Изучение протеасоме Ассамблею с рекомбинантным архейных Протеасомы и нативных ПААГ: Случай для комбинированного подхода
Summary
Этот протокол использует как субъединицу коэкспрессия и postlysis субъединицу смешивания для более тщательного изучения рекомбинантного протеосомного сборки.
Abstract
Протеасомы встречаются во всех областях жизни. Они обеспечивают основной путь внутриклеточной деградации белка у эукариот, хотя их сборка не до конца понятен. Все протеасомы содержат структурно законсервированный основную частицу (СР), или 20S протеасомы, содержащие два heptameric -субъединицы кольца зажатой между двумя heptameric α субъединиц колец. Архейных 20S протеасомы композиционно проще по сравнению с их аналогами эукариотических, но они оба имеют общий механизм сборки. Следовательно, архейных 20S протеасомы продолжают оставаться важными моделями для эукариотической протеасомы сборки. В частности, экспрессия рекомбинантного архейных 20S протеасом в сочетании с нативных электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) принесло много важную информацию о протеосомного биогенеза. Здесь мы обсудим средства для улучшения при обычной стратегии соэкспрессии архейных протеосом альфа и бета субъединиц до nondenaturiнг СТР. Показано, что, хотя быстрый и эффективный, A коэкспрессия подход один может пропустить ключевые промежуточные сборки. В случае протеасомы, коэкспрессия не может позволить обнаружение половинной протеасомы, промежуточный, содержащий один полный альфа-кольцо и один полный бета-кольцо. Тем не менее, этот промежуточный продукт легко обнаруживается с помощью лизата смешивания. Мы полагаем, что сочетание коэкспрессия с лизата смешивания дает подход, который более тщательно при анализе сборки, пока остается труд nonintensive. Этот подход может быть полезен для изучения других рекомбинантных мультибелковых комплексов.
Introduction
Мультибелковых комплексы осуществляют многочисленные критические клеточные активности 1. Для многих из этих комплексов, известно гораздо больше о своей структуре и функции , чем об их сборке 2,3. Протеасома является одним из таких комплексов и встречается во всех областях жизни. У эукариот, эта молекулярная машина находится в ядре системы убиквитин / протеасоме (ИБП) и обеспечивает основной путь деградации внутриклеточного белка 4. Эукариотической Протеасома (называемый протеасомы 26S) состоит из двух основных сборочных узлов: в 20S протеасомы, или коровой частицы (СР) 5, которые могут быть блокированы на одном или обоих концах посредством 19S регуляторной частицы (РП) 6.
Протеасома 20S является большой разобщенным протеазы. Его четвертичная структура абсолютно сохраняется во всех областях жизни и состоит из набора из четырех из семи членные кольца, содержащие два типа структурно родственных субъединиц, α; и & beta ; 5,7,8. В эукариот, два внешних кольца каждое из которых состоит из семи различных а субъединиц и два внутренних кольца каждое из которых состоит из семи различных субъединиц; протеолитическая активность находится в пределах трех субъединиц. В противоположность этому, CP кольца архебактерий и бактерий, как правило, состоят только из одного типа а и одного типа -субъединицы. Архейных протеасомы обеспечили важную модельную систему для изучения сборки протеасомы как за счет их композиционной простоты и их обмена общий механизм сборки с их аналогами эукариотических 9-13. Короче говоря, альфа-субъединицы собираются в кольца альфа-первых, которые служат в качестве каркаса, на который субъединиц собрать. Полученные в результате сводными протеасомы (α β 7 7) димеризуются, порождая в полностью собранном виде CP (α β 7 7 β 7 α 7). Во время димеризации, в пропептиды присутствует на субъединицявляются аутокаталитически удалены, подвергая каталитические N-концевые треонина. Использование архейных протеасомах для сборки модели часто использует преимущества получения рекомбинантных архейных протеосом белков в кишечной палочки. Это очень важный подход, поскольку он позволяет субъединиц производить в различных комбинациях, и как WT и мутантных версий, в организме-хозяине, которая не производит свои собственные протеасомы.
Контроль сборки нескольких белковых комплексов биохимически требует какой-то метод фракционирования, отделяющей в полностью собранном виде комплексов из сборочных промежуточных и прекурсоров. Благодаря своей превосходной разрешающей способности, нативных полиакриламидного гель электрофореза (PAGE), оказалось особенно полезным при фракционировании различных крупных мультибелковых комплексов 14-17 лет. Сочетание рекомбинантного архей производства протеосомного и неденатурирующем СТР стала мощным подходом в dissectinг Протеасома сборки 9,11,12,18. Тем не менее, обычный метод , с помощью которого применяется этот подход (т.е.. С помощью рекомбинантного соэкспрессии альфа и бета субъединиц) имеет существенный недостаток. Реакции Сборочные кооперативное и сильно зависит от концентрации 3. Учитывая , что концентрация белка внутри клеток очень высока 19, из – за эффектов исключенного объема, сборочные реакции протекают быстро в естественных условиях. Следовательно, можно пропустить важные промежуточные сборки, когда а и р субъединиц коэкспрессируются.
Здесь мы приводим доводы в пользу комбинированного подхода в изучении сборки протеасомы с использованием рекомбинантных архейных протеосом субъединиц. При таком подходе используются оба соэкспрессии и лизат методы смешивания. Первый позволяет быстрый анализ сборки, поскольку коэкспрессия является менее трудоемким. Последнее зависит от отдельного выражения а и р субъединиц с последующим перемешиванием. Хоть это requiРез немного больше усилий, чем соэкспрессии, это больше, чем компенсируется способностью обнаруживать промежуточные продукты, которые пропущены во время соэкспрессии. Вместе эти два метода могут дать более полную картину сборки протеасомы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Показано преимущество комбинированного подхода к анализу сборки протеасомы путем неденатурирующем PAGE с использованием рекомбинантных архейных протеасомы. Обычный метод 9,11 бактериального соэкспрессии субъединиц протеасом позволяет для экспресс – анализа , но не может выявить …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана Исследовательского фонды поддержки Грант (RSFG) из Университета Индианы-Университета Пердью, Индианаполис, и частично награду от Американской ассоциации сердца 14GRNT20390154, чтобы ARK
Materials
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective equipment |
| Amicon ultra 0.5ml centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E.coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized-cobalt affinity resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson, J. R. Cooperativity in macromolecular assembly. Nat Chem Biol. 4, 458-465 (2008).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 192, 319-360 (2012).
- Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
- Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
- Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
- Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
- Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W. Critical elements in proteasome assembly. Nat Struct Biol. 1, 765-770 (1994).
- Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
- Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
- Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
- Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1, 418-428 (2006).
- Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
- Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
- Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
- Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
- Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).
