Encelliga genuttryck Använda Multiplex RT-qPCR att karaktärisera Heterogena Sällsynta Lymfoida populationer

Under de senaste åren, medfödda lymfoidceller (ILCS) har blivit allt undersökts. Trots bristen på antigenspecifika receptorer, de tillhör den lymfoida härstamningen och utgör viktiga sentinels för vävnads homeostas och inflammation. ILCS närvarande delas in i tre grupper baserat på deras uttryck av specifika transkriptionsfaktorkombinationer och deras förmåga att producera cytokiner ^{6, 7.}

ILCS bidrar till många homeostatiska och patofysiologiska situationer i olika organ via specifik cytokinproduktion ^{8, 9.} För att kunna förstå vilken roll dessa celler, är det viktigt att bestämma de olika ILC subpopulationer per organ och att identifiera deras utvecklings relationer. Dessutom har fenomenen plasticitet mellan de olika undergrupper varit relaterade. Genom att studera heterogenitetav celler i ett organ, är det möjligt att avgränsa sitt stadium av mognad och att skilja sina specifika funktioner.

För att illustrera tekniken av encelliga multiplex RT-qPCR var lever ILCS valt, med särskild tonvikt på deras heterogenitet inom samma ILC grupp (typ 1 ILC) ^10. Först, genom användning av flödescytometri, har tre distinkta ILC populationer kännetecknad av levern. Grupp 1 ILC utgör ca 80% av de medfödda effektenheter, medan de två andra populationer är sällsynta lever ILC populationer (mindre än 5% av de medfödda effektorer). Dessa populationer sorterades med hjälp av allmänt uttryckta på cellytan markörer för ILC populationer. Som ett resultat, sorterade ILC populationer i levern ser i stort sett likadan till en annan.

Encelliga multiplex RT-qPCR har framträtt som en av de bästa teknikerna att snabbt undersöka heterogenitet av dessa populationer ¹¹ </supp>. Två huvudsakliga egenskaper bestäms genom att utnyttja den encelliga multiplex RT-qPCR teknik. Först, genom att titta på klonnivå, är det möjligt att återvinna cellspecifika genuttryck för jämförelse mellan celler som uppenbarligen visar liknande utvecklingsstadier. Sedan, genom att titta på en i förväg utvald kombination av genuttryck, kommer vi bestämma ny gen signaturer baserade på samtidiga genexpressionsmönster vid en tidpunkt. Dessa aspekter medger insamling av en stor mångfald av expressionsdata för ett stort antal celler, även om sällsynta populationer, eftersom den teknik som utförs vid den klonala nivån. Därigenom kan ILC heterogenitet i levern bedömas på lämpligt sätt.

Därefter genom att sortera alla celler med en global ILC fenotyp, är en bred översikt över flera genuttryck i levern ILC populationer erhållas, trots att de utgör ytterst sällsynta populationer. En mikroflödessystem-baserad chip gör experiment med ännuen liten mängd cellmaterial. Som en konsekvens, kan de genuttrycksprofilerna av sällsynta cellpopulationer erhållas. Använda online-gen signaturanalys programvara, cellpopulationen kluster och potentiella cellförhållanden kan undersökas. Följaktligen kan funktionstester utföras för att validera klusterdata vid in vivo nivå.

Tiotals genuttryck kunde bedömas samtidigt på hundratals eller fler enkla celler på samma chip ^{3, 11, 12.} Utformningen av analysen är den längsta och viktigaste delen av experimentet. Bestämningen av de gener som är relevanta för den hypotesen som ska provas är av största vikt för att erhålla relevanta resultat. För det andra behövs för intern kontroll (såsom kända ytmarkörer används för att sortera) och särskilda kontroller. Detta är avgörande för att testa primern amplifieringsspecificitet, effektiviteten i amplifieringen, och tHan frånvaro av föregångare konkurrens. Därför, som arbetar med encelliga multiplex RT-qPCR är en tidsbesparande teknik, såsom multipel-genuttryck hos en cell bedöms på samma gång.

Med användning av samma chip och blandning av reagens för alla celler begränsar eventuella fel för manipulation och tillåter reproducerbarhet mellan prover. Sammantaget, de olika aspekterna av encelliga multiplex RT-qPCR möjliggör produktion av mycket tillförlitliga resultat på klonnivå, med en stor grad av känslighet för en mängd olika prover och gener. De erhållna resultaten ger kraftfulla och robusta data för biostatistiska tester.

Detta kan uppnås på grund av den mikroflödes aspekt av förfarandet, som möjliggör arbete med mycket små mängder av material och leder till uttömmande resultat. Slutligen, med hjälp av programvara online, är det möjligt att jämföra de önskade populationer.