Desarrollo de un sistema reportero virus de la hepatitis B para supervisar las primeras etapas del ciclo de replicación
Summary
Aquí se describe un virus de la hepatitis B de nuevo desarrollo sistema indicador (HBV) para supervisar las primeras etapas del ciclo de vida de HBV. Esta simplificado sistema in vitro ayudará en la selección de agentes anti-HBV utilizando una estrategia de alto rendimiento.
Abstract
Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.
Introduction
La infección crónica por el virus de la hepatitis B (VHB) es un factor de riesgo importante para las enfermedades hepáticas crónicas 1. Aunque las estrategias terapéuticas actuales se basan en análogos de nucleótidos que inhiben la función HBV pol y / o la administración de interferón de tipo I que activa la respuesta inmune en individuos infectados, así como indirectamente la supresión de la proliferación de HBV a través de funciones de genes de interferón-estimulado 2, estos tratamientos no pueden eliminar HBV ADN completo 3. Por otra parte, la aparición de HBVs que son resistentes a los agentes anti-pol es motivo de preocupación 4. La administración de agentes anti-virales combinados dirigidos directamente los diferentes pasos del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o el ciclo de vida del virus de la hepatitis C (HCV) se demostró con éxito para suprimir o erradicar el virus (es). Similar a esta idea, el desarrollo de anti-HBV agente (s) que actúan directamente sobre las diferentes etapas de la HBV ciclo de vida es importante para el establecimiento de futuras terapias VHB.
En general, el establecimiento de una sencilla en el sistema de cultivo in vitro del virus objetivo facilita el desarrollo de agentes anti-virus. Sin embargo, hay al menos dos barreras para el desarrollo de sistemas de cultivo in vitro para detectar agentes anti-HBV. El primero es la falta de un sistema conveniente in vitro de células de cultivo para el VHB infección / proliferación. A diferencia de otros virus, como el VIH y el VHC, que se propagan en líneas celulares establecidas, es difícil de cultivar HBV in vitro debido a las limitaciones experimentales incluyendo un estrecho rango de huéspedes. El uso de sistemas de cultivo de células específicas, tales como la línea celular de hepatoma humano HepaRG, que es susceptible a la infección por HBV, 5, 6, 7 se han desarrollado para superar estos problemas. Por otra parte, las células PXB, aisladas de uroquinasa-type activador del plasminógeno transgénico / ratones SCID inoculados con hepatocitos humanos primarios (PHH), se demuestra que es susceptible a la infección por HBV y la replicación 8. Sin embargo, los niveles de replicación del VHB en HepaRG dependen del estado de diferenciación celular después del cultivo, lo que puede causar que los resultados inconsistentes e irreproducibles de los niveles de infección / replicación del VHB. PXB se utiliza comúnmente para experimentos de infección de HBV, pero está limitada por su disponibilidad. Una línea celular de expresión VHB inducible de tetraciclina, HepAD38, también ha sido ampliamente utilizado para estudiar la replicación del VHB, pero este sistema sólo permite la evaluación después de la transcripción y no en la etapa de entrada de la infección por HBV 9. Recientemente, la identificación de polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio (PNCT) como un receptor funcional para HBV ha permitido el desarrollo de un sistema de cultivo de HBV variable de 10. De hecho, la expresión en células de hepatocarcinoma PNCT no susceptibles tales como Huh7 yHepG2 permite la infección por VHB 10 y por lo tanto, la elección de líneas de células susceptibles de HBV se ha ampliado, la resolución de muchas de las limitaciones experimentales. El segundo problema es la falta de un sistema de ensayo sencillo para evaluar la infección por VHB y la replicación. Evaluación de la infección por VHB se realiza normalmente mediante el análisis VHB ADN, ARN y proteínas. Sin embargo, la cuantificación de estos marcadores de virus es mucho tiempo, a menudo costoso y no siempre es sencillo. Por lo tanto, el desarrollo de un sistema de ensayo simple, como el uso de un gen indicador, podría superar los problemas asociados con sistemas de ensayo de HBV.
Sin embargo, debido a que el tamaño del genoma que puede ser empaquetado en una cápside de HBV se limita – menos de 3,7 kb 11 – el tamaño de un gen indicador debe ser tan corto como sea posible. Por otra parte, la presencia de múltiples elementos cis dispersos por todo el genoma, que son esenciales para la replicación viral, limita las posiciones disponibles en el la inserción del gen informador en el genoma. Varios informes han tratado de insertar genes extraños, incluyendo el VIH-1 Tat, proteína fluorescente verde, y DsRed, en el genoma de HBV 11, 12, 13. Sin embargo, estos HBVs recombinantes no son útiles para la detección de HBV infección / replicación, o para el cribado de alto rendimiento de los factores que afectan a la infección por VHB / replicación. Esto es principalmente debido a la baja productividad de virus recombinantes y la reducción de la intensidad de expresión del gen indicador causada por la producción de virus ineficiente.
Para superar estos problemas, se construyó un reportero de VHB con un alto rendimiento de la producción de virus. Este virus es altamente sensible para el seguimiento de las primeras etapas del ciclo de replicación de HBV, desde la entrada a la transcripción. Para lograr esto, NanoLuc (NL) fue elegido como un gen marcador, ya que es un pequeño (171 aminoácidos) diseñados reportero luminiscenteclass = "xref"> 14. Además, NL es aproximadamente 150 veces más brillante que la luciérnaga o luciferasa de Renilla, y la reacción luminiscente es independiente de ATP, lo que sugiere que la tasa de éxito falsa será baja para cribado de alto rendimiento. La eficiencia de la producción de la HBV recombinante es de aproximadamente 1/5 de los padres HBV, y similar a los niveles reportados para los virus recombinantes de HBV anteriores; sin embargo, el brillo de NL supera problemas de productividad virus para que pueda ser utilizado para el cribado en masa de agentes anti-HBV.
Cribado de agentes anti-HBV utilizando hepatocitos primarios, HepaRG, HepAD38 y hepatocitos PNCT-transducidas podría ser útil para el cribado de agentes anti-VHB por método (s) convencional. Sin embargo, el sistema descrito aquí tiene varias ventajas, tales como el manejo sencillo, alta sensibilidad y bajo costo para el cribado. Estas ventajas son adecuados para ensayos de alto rendimiento para desarrollar e identificar nuevos agentes de HBV con fines terapéuticos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El genoma HBV tiene cuatro marcos principales de lectura abiertos (ORFs), incluyendo el núcleo, la polimerasa, de superficie y X ORFs (Figura 1). La transcripción de estos cuatro VHB ORFs está estrechamente regulada por cuatro promotores: el promotor precore / núcleo que contiene potenciador II, promotor S1, S2 promotor y X promotor que contiene promotor de I 18. Los ARNm de 3,5 kb y 3,4 kb se traducen en proteínas pre-core y Core, respectivamente. La proteína de la envoltu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Research Program on Hepatitis from Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) and by Grants-in-Aids for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan.
Materials
| Nano-Glo Luciferase Assay Regent | Promega | N1110 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai tesque | 09367-34 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| 100 mm/collagen-coated dish | Iwaki | 4020-010 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 6000 | Sigma-Aldrich | 81255 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| NaCl | Nacalai tesque | 31319-45 | |
| 0.5 mol/l-EDTA Solution | Nacalai tesque | 06894-14 | |
| Tris-HCl | Nacalai tesque | 35434-21 | |
| Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter | Merck Millipore | SLHP033RS | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Collagen coated 96-well plate | Corning | NO3585 | |
| Passive Lysis 5xBuffer | Promega | E1941 | |
| GloMax 96 Microplate Luminometer | Promega | E6501 | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30403-55 | |
| Luminometer plate | Greiner bio-one | 655075 | |
| HepG2-NTCP1-myc-clone22 | – | – | Reference 15 |
| pUC1.2HBV delta epsilon | – | – | Reference 15 |
| pUC1.2HBV/NL | – | – | Reference 15 |
| 50 ml tube | Violamo | 1-3500-02 | |
| Anti-Myc antibody | Sigma-Aldrich | C3956 | |
| HBIG | Japan Blood Products Organization | – | |
| IFN-β | Mochida Pharmaceutical | 14987224005413 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 |
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