Développement d'un système de virus de l'hépatite B Reporter pour surveiller les premiers stades du cycle de réplication
Summary
Nous décrivons ici un virus nouvellement mis au point contre l'hépatite B (VHB) système rapporteur pour surveiller les premiers stades du cycle de vie du VHB. Cette simplifiée système in vitro aidera dans le criblage d'agents anti-VHB en utilisant une stratégie à haut débit.
Abstract
Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.
Introduction
L' infection chronique par le virus de l' hépatite B (VHB) est un facteur de risque majeur pour les maladies chroniques du foie 1. Bien que des stratégies thérapeutiques actuelles sont basées sur des analogues de nucléotides qui inhibent la fonction du VHB pol et / ou l'administration d'interféron de type I qui activent les réponses immunitaires chez les individus infectés, ainsi que la suppression indirectement la prolifération du VHB par les fonctions des gènes d' interféron stimulées 2, ces traitements ne peuvent pas éliminer le VHB ADN complètement 3. En outre, l'émergence de HBVs qui sont résistantes aux agents anti-pol est préoccupante 4. L'administration d'agents anti-viraux combinés ciblant directement les différentes étapes du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) ou le virus de l'hépatite C (VHC) cycle de vie a été démontré avec succès pour supprimer ou éradiquer le virus (es). Semblable à cette idée, le développement d'un agent anti-VHB (s) qui agissent directement sur les différentes étapes du Hcycle de vie BV est important pour l'établissement de futures thérapies de HBV.
En général, la mise en place d'un simple système de culture in vitro du virus de la cible facilite le développement d'agents anti-viraux. Cependant, il existe au moins deux barrières au développement de systèmes in vitro de culture pour cribler des agents anti-VHB. La première est l'absence d'un système in vitro de la culture cellulaire convenable pour l' infection par le VHB / prolifération. Contrairement aux autres virus, comme le VIH et le VHC, qui se propagent dans des lignées cellulaires établies, il est difficile de cultiver le VHB in vitro en raison des limitations expérimentales , y compris une gamme d'hôtes étroite. L'utilisation de systèmes de culture de cellules spécifiques , telles que la lignée cellulaire d'hépatome humain HepaRG, qui est sensible à l' infection par le VHB, 5, 6, 7 ont été développées pour surmonter ces problèmes. En outre, les cellules PXB, isolées urokinase-type activateur du plasminogène transgénique / souris SCID inoculées avec primaire hépatocytes humains (PHH), ont été montrés pour être sensibles à l' infection HBV et la réplication 8. Cependant, les niveaux de réplication du VHB dans HepaRG dépendent de l'état de différenciation cellulaire après la culture, ce qui peut provoquer des résultats incohérents et non reproductibles de HBV niveaux d'infection / de réplication. PXB est couramment utilisé pour le VHB expériences d'infection, mais est limitée par la disponibilité. Une lignée cellulaire d'expression inductible du VHB à la tetracycline, HepAD38, a également été largement utilisée pour étudier la réplication du VHB, mais ce système ne permet qu'une évaluation après la transcription , et non à l'étape d'infection par le VHB 9 d'entrée. Récemment, l'identification d' un polypeptide du taurocholate de sodium cotransporting (PNT) en tant que récepteur fonctionnel pour le VHB a permis le développement d'un système de culture de VHB 10 variables. En effet, l'expression NTCP dans les cellules d'hépatocarcinome non sensibles tels que Huh7 etHepG2 permet l' infection par le VHB 10 et , par conséquent, le choix du VHB lignées cellulaires sensibles a été étendue, résoudre un grand nombre des limitations expérimentales. Le deuxième problème est le manque d'un système de test simple pour évaluer l'infection par le VHB et la réplication. L'évaluation de l'infection par le HBV est habituellement effectuée en analysant l'ADN du VHB, l'ARN et les protéines. Cependant, la quantification de ces marqueurs de virus est consommatrice de temps, souvent coûteux et pas toujours simple. Par conséquent, le développement d'un système de dosage simple, par exemple en utilisant un gène rapporteur, peut surmonter les problèmes associés aux systèmes de dosage du VHB.
Cependant, parce que la taille du génome qui peut être emballé dans une capside du VHB est limitée – moins de 3,7 kb 11 – la taille d'un gène rapporteur doit être aussi courte que possible. En outre, la présence de plusieurs éléments cis dispersés à travers le génome, qui sont essentielles à la réplication virale, limite les positions disponibles dans sertion du gène rapporteur dans le génome. Plusieurs rapports ont tenté d'insérer des gènes étrangers, y compris le VIH-1 Tat, la protéine fluorescente verte, et DsRed dans le génome du VHB 11, 12, 13. Cependant, ces HBVs recombinants ne sont pas utiles pour le criblage de l'infection par le VHB / réplication ou pour le criblage à haut débit des facteurs qui influent sur l'infection par le VHB / réplication. Ceci est principalement en raison de la faible productivité des virus recombinants et de l'intensité de l'expression réduite du gène reporter provoquée par la production du virus inefficace.
Pour surmonter ces problèmes, nous avons construit un HBV rapporteur avec un rendement élevé de la production de virus. Ce virus est hautement sensible pour la surveillance des premiers stades du cycle de réplication du VHB, depuis l'entrée jusqu'à la transcription. Pour ce faire, NanoLuc (NL) a été choisi comme un gène marqueur, car il est un petit (171 acides aminés) conçus reporter luminescenteclass = "xref"> 14. De plus, NL est environ 150 fois plus brillante que luciole ou Renilla luciférase, et la réaction luminescente est ATP-indépendante, ce qui suggère que le taux de succès de faux sera faible pour le criblage à haut débit. L'efficacité de l'hépatite B recombinant de production est d'environ 1/5 du parent VHB et similaires aux taux indiqués pour les virus recombinants précédents du VHB; Cependant, la luminosité NL surmonte les problèmes de productivité du virus de sorte qu'il peut être utilisé pour le criblage de masse d'agents anti-VHB.
Dépistage des agents anti-VHB en utilisant des hépatocytes primaires, HepaRG, HepAD38 et hépatocytes NTCP-transduites pourrait être utile pour le criblage d'agents anti-VHB par la méthode (s) classique. Cependant, le système décrit ici présente divers avantages tels que la manipulation simple, une sensibilité élevée et un faible coût pour le dépistage. Ces avantages sont appropriés pour des essais à haut débit afin de développer et d'identifier de nouveaux agents de HBV à des fins thérapeutiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le génome du VHB a quatre trames primaires de lecture ouverts (ORF) , y compris le noyau, la polymerase, de surface et X ORFs (Figure 1). La transcription de ces ORFs quatre HBV est étroitement régulée par quatre promoteurs: le promoteur précore / noyau contenant activateur II, promoteur S1, S2 promoteur et X promoteur contenant activateur I 18. Les 3,5 kb et 3,4 kb ARNm sont traduits en protéines Precore et Core, respectivement. La grande protéine d'enveloppe (L) est …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Research Program on Hepatitis from Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) and by Grants-in-Aids for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan.
Materials
| Nano-Glo Luciferase Assay Regent | Promega | N1110 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai tesque | 09367-34 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| 100 mm/collagen-coated dish | Iwaki | 4020-010 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 6000 | Sigma-Aldrich | 81255 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| NaCl | Nacalai tesque | 31319-45 | |
| 0.5 mol/l-EDTA Solution | Nacalai tesque | 06894-14 | |
| Tris-HCl | Nacalai tesque | 35434-21 | |
| Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter | Merck Millipore | SLHP033RS | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Collagen coated 96-well plate | Corning | NO3585 | |
| Passive Lysis 5xBuffer | Promega | E1941 | |
| GloMax 96 Microplate Luminometer | Promega | E6501 | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30403-55 | |
| Luminometer plate | Greiner bio-one | 655075 | |
| HepG2-NTCP1-myc-clone22 | – | – | Reference 15 |
| pUC1.2HBV delta epsilon | – | – | Reference 15 |
| pUC1.2HBV/NL | – | – | Reference 15 |
| 50 ml tube | Violamo | 1-3500-02 | |
| Anti-Myc antibody | Sigma-Aldrich | C3956 | |
| HBIG | Japan Blood Products Organization | – | |
| IFN-β | Mochida Pharmaceutical | 14987224005413 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 |
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