تصور آثار البلغم للتنمية بيوفيلم باستخدام نموذج غرف ساترة
Summary
This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.
Abstract
تتكون الأغشية الحيوية من مجموعة من البكتيريا المغطى في مصفوفة يفرز النفس. أنها تلعب دورا هاما في التلوث الصناعي وكذلك في تطوير واستمرار العديد من الأمراض المتصلة بالصحة. تحدث أحد الأغشية الحيوية صفها وصفا جيدا ودرس في الأمراض التي تصيب البشر في عدوى الالتهاب الرئوي المزمن من مرضى التليف الكيسي. عند دراسة الأغشية الحيوية في سياق المضيف، يمكن أن العديد من العوامل تؤثر تشكيل بيوفيلم والتنمية. من أجل تحديد مدى العوامل المضيفة قد تؤثر على تشكيل بيوفيلم والتنمية، استخدمنا طريقة ساترة تشامبيريد ثابت للنمو الأغشية الحيوية في وجود عوامل المستمدة من المضيفة في شكل supernatants البلغم. هي المصنفة البكتيريا في غرف ومعرضة للالرواشح البلغم. وبعد 48 ساعة من النمو، هي ملطخة الأغشية الحيوية مع بيوفيلم مجموعة الجدوى التجارية قبل الفحص المجهري متحد البؤر والتحليل. وبعد الحصول على الصور، والخصائص بيوفيلم يمكن تقييم استخدام منصات البرمجيات المختلفة.هذا الأسلوب يسمح لنا تصور الخصائص الأساسية للنمو بيوفيلم في وجود مواد مختلفة بما في ذلك المضادات الحيوية.
Introduction
الأغشية الحيوية البكتيرية هي مجموعات من الكائنات الحية الدقيقة التي تعلق على بعضها البعض، والمغطى في مصفوفة يفرز النفس. 1،2 كلاسيكي، إلا أنها تمثل البكتيريا تعلق بدنيا لسطح اللاأحيائي أو الحيوية شكلت في ظل ظروف التدفق. وقد تبين أيضا الأغشية الحيوية للنمو في ظروف ثابتة (غياب تدفق) والقاصي من السطوح، مثل في واجهة الهواء السائل من الحمامات الحرارية أو pellicles شكلت في أنابيب الاختبار. منذ فترة طويلة التعرف على هذه الأغشية الحيوية في البيئة وهم اذى رئيسيا في العمليات الصناعية، كما أنها يمكن أن تشكل في خزانات المياه أو في الأنابيب، مما أدى إلى biofouling والتآكل والعقبات. 3،4
الأغشية الحيوية هي أيضا حاسمة في مرافق الرعاية الصحية، كما ثبت أن تشارك في العدوى المرتبطة القسطرة، والالتهابات الرئوية في مرضى التليف الكيسي، وكذلك في التهابات أخرى عديدة. 5،6 واحدة من السمات المميزة لالتهابات بيوفيلم هي ديمجعدة قابلية البكتيريا للمضادات الحيوية وضعاف إزالة من قبل النظام المناعي الفطري. 7-9 درست معظم جيدا، والسيناريوهات ذات الصلة سريريا تنطوي عدوى القائم على بيوفيلم يحدث في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي (CF)، المصابين المزمنين مع الأغشية الحيوية الزنجارية الزائفة. الزائفة الزنجارية يمكن أن يخضع لعدد من التغييرات خلال إنشاء عدوى مزمنة تجعل من الصعب جدا لعلاج. يمكن 10،11 الأغشية الحيوية تفعيل تفاضلي المناعة الفطرية ودفع الالتهاب. 12-14 وهذه الالتهابات تؤدي إلى زيادة معدلات الاعتلال والوفيات في مرضى التليف الكيسي، فمن الأهمية بمكان أن نفهم العوامل التي يمكن أن تؤثر على التنمية بيوفيلم في هذا السياق.
وتشير دراسة حديثة إلى أن العوامل المضيفة هي الحاسمة في تشكيل المجاميع بيوفيلم الزائفة الزنجارية. وتساهم 15 هذه الأغشية الحيوية لتقليل التعرض للمضادات الحيوية وآليات دفاع المضيف. وبريسيالامتحانات التنافسية الوطنية من العوامل المستمدة من المضيفة، كالإيلاستاز العدلة، فضلا عن المنتجات يفرز من الكائنات الدقيقة الموجودة في CF الرئة، لديها القدرة على تعديل إلى حد كبير تشكيل بيوفيلم والتنمية. 16 وبالإضافة إلى ذلك، الأغشية الحيوية تتفاعل مع المضيف لتعديل تعبير عن العديد من الممرات وبدء الالتهاب. في حين أساليب إنتاجية عالية، مثل معيار فحص الكريستال البنفسجي، يمكن أن توفر بعض المعلومات فيما يتعلق بعملية بيوفيلم، والتصور للبيوفيلم ردا على هذه العوامل توفر مزيد من المعلومات المتعمقة.
في هذه المخطوطة وصفنا طريقة لاستخدام عوامل من البلغم من المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي لدراسة تطوير الأغشية الحيوية في المختبر. وتسمح هذه الطريقة لتصور السريع الأغشية الحيوية تتعرض لعوامل المضيف البلغم التي تحتوي على استخدام عدة قابلية بيوفيلم التجارية. هذه التقنية يمكن استخدامها لتحديد بصريا التغييرات التي تحدث أثناء نمو بيوفيلم في وجود exogenoلنا المنتجات، ويمثل طريقة تحسين لتحليل التغيرات في التنمية بيوفيلم في ظل ظروف مختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطرق الموضحة في هذه الوثيقة تسمح لتصور الأغشية الحيوية البكتيرية التي تزرع في وجود المنتجات الخارجية. ليس من المستغرب أن إنتاج exoproducts له أهمية عند استخدام هذا النوع من النظام. على سبيل المثال، Dithiothreitol (DTT)، وغالبا ما تستخدم على عينات البلغم الإنسان لمساعدة تسييل الع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
السل يعترف زمالة بحثية من التليف الكيسي كندا.
Materials
| Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well | Thermo Sicher Scientific | 155409 | |
| Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit | Thermo Fisher Scientific | L10316 | |
| Blood agar plates | Thermo Fisher Scientific | R10215 | Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation |
| COMSTAT | Availble software online | COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk | |
| Millers LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780-052 | Standard media for overnight gowth/biofilm growth |
| Millex-GV Syringe Filters | Millipore | SLGV013SL | Filtering of sputum supernants |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | Oxoid | BR0014G | Washing of biofilm chambers after media removal |
| Zeiss AxioVert 200M | Carl Zeiss | ||
| Hamamatsu C9100-13 EM-CCD | QS Technologies Inc. | ||
| Spectral Borealis | Qs Technologies Inc. | ||
| Perkin Elmer Volocity | QS Technologies Inc. | Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf |
References
- Beaudoin, T., Waters, V. Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy. Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
- Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes. FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).
- Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development. Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).
- Donlan, R. M. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O’Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada. Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).
- Vidya, P., et al. Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).
- Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).
- Beaudoin, T., et al. The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).
- LaFayette, S. L., et al. Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses. Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).
- Staudinger, B. J., et al. Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).
- Kennedy, S., et al. Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).
- Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Vorregaard, M. . Informatics and Mathematical Modelling. , (2008).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide. J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).
