クリア胚ハーツにおける冠状血管の分析

すべての動物実験は、英国内務省からのライセンスの下で施設のガイドラインに準じて行きました。 1.解剖および胚ハーツの固定倫理的に承認されたカリング技術、頸椎脱臼に続いて、例えば、CO 2ナルコーシス、およびリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で満たされた10センチメートルペトリ皿に置く、胚嚢14を削除を使用して、必要な日に時限妊娠マウスを安楽死させます。 解剖顕微鏡や鉗子を使用して、慎重に臍帯を切断し、卵黄嚢の除去、子宮嚢を開き、各胚を削除します。 ジェノタイピングのために、後に溶解/ DNA抽出1.5 mlのマイクロ遠心チューブに胚の尾と場所を削除します。 ステンレス鋼minutienピンを使用して、PBSで満たされたシリコーンエラストマーでコーティングされた35ミリメートルペトリ皿中のその背中に各胚を、心を取り除く固定するためです。 、CAの細かい鉗子を使用してrefully胸を開き、大血管を切断、心に前方。その後、ピンセットで心臓の後ろに達し、心臓の背後にある血管を把握し、心を取り除くためにそっと引き出します。肺も同時に離れて来るかもしれません。 PBSを含む新鮮な35ミリメートルのペトリ皿に心を移し、必要に応じて、肺組織を切り取るために細かい鉗子を使用しています。その後、冷PBSで満たされた48ウェルプレートのウェルに心を移します。 48ウェルプレート内のすべての心を収集した後、先の細いプラスチックパスツールピペットでPBSを吸引し、0.5ミリリットルの4％パラホルムアルデヒド（PFA）と交換してください。 注意：PFAは、アレルギー性の発癌性、および毒性があることが知られています。 修正E11.5 – 室温で4％PFAで30分間15.5心、 – 20分とE14.5 12.5 15分間の心、E13.5の心。 先の細いプラスチック製パスツールピペットでPFAを吸引し、心の2倍の冷PBSでリンス。 CAUTION：PFAが危険であると制度の規制に従って、廃棄する必要があります。 25％メタノール/ 75％PBS、50％メタノール/ 50％PBS、75％メタノール/ 25：全体のマウント免疫染色のために直ちに使用しない場合は、以下の溶液に連続した5分間の洗浄を行うことで心を脱水、（セクション2を参照） ％PBS。 注意：メタノールは毒性があり、手袋を着用してください。 100％メタノール中で-20℃で心を保管してください。 抗PECAM1抗体による胚ハーツの2ホールマウント免疫染色注：抗PECAM1抗体は冠状血管を染色するために働くが、適切であろう強いシグナルを与える任意の汎内皮マーカー（ステップ2.4を参照してください）。 100％メタノールに記憶されている心を使用している場合は、1.5ミリリットルのマイクロチューブに移し、以下のソリューションでの連続した5分間の洗浄を行うことにより再水和：75パーセントをメタノール/ 25％PBS、50％メタノール/ 50％PBSおよび25％メタノール/ 75％PBS。 </li> 室温で回転し、1.0ミリリットルPBST（PBS / 0.1％のTween-20） – 0.5で3×10分間の洗浄を行うことで心を透過性。 PBSTで1.0ミリリットルの10％ヤギ血清で、室温で1時間回転させることによって、心をブロックします。 先の細いプラスチックパスツールピペットまたは千μlのピペットチップでブロッキング緩衝液を除去し、400と交換 – 1時50希釈した抗PECAM1の一次抗体を含有する500μlの新鮮なブロック。 4℃で一晩チューブを回転させます。 次の日は、室温でチューブを回転させ、先の細いプラスチック製パスツールピペットまたは千μlのピペットチップでブロック/一次抗体を吸引し、1.0ミリリットルPBST中で少なくとも6×1時間の洗浄を行います。 1希釈したフルオロフォア結合二次抗体を含有する新鮮なブロッキングバッファーで最後の洗浄に置き換え：500を、回転して、4℃で一晩インキュベートします。ホイルでチューブを包むことにより、光から保護します。 翌日、ブロック/秒を吸引先の細いプラスチック製パスツールピペットで次側抗体とは、室温でチューブを回転させ、1.0ミリリットルPBST中で少なくとも6×1時間の洗浄を行います。 必要になるまで4°C（光から保護）に心を保管してください。 クリアソリューションおよび顕微鏡料理の調製注：BABBで心を撮影するとき、BABBソリューションのいずれも、顕微鏡の部品と接触しないことが重要です。この目的のために、以下のプロトコルは、事前に調製することができる蛍光顕微鏡に適したシリコーンエラストマー封止型料理を、調製するための命令が含まれています。シリコーンエラストマーは、BABBを含み、潜在的にガラス底皿のポリカーボネート側の間浸入を防止するための障壁を提供します。 直径シリコーンエラストマーでコーティングされた料理を準備するには、スクリュートップバイアルを4ミリリットルからキャップを光学ガラス底の培養皿を取り、置く（約1.5センチメートル）各皿の中心インチ注：エラストマーを皿に適用した場合、このサンプルのために十分に形成します。 製造者の指示に従って、それらが適用されるように、2つの成分を混合するために、アプリケータカートリッジを使用して、約0.5センチメートルの深さまでシリコーンエラストマーと料理を記入してください。バイアルキャップは、各皿の中央に残っていることを確認して、少なくとも24時間硬化させるために残します。 注：目でシリコーンエラストマーの偶発的な接触を避けるために、安全メガネを使用してください。 エラストマーを硬化させた後、各ディッシュからバイアルキャップを取り外し、これは試料皿のガラス底部に直接接触して配置することができる撮像される中央のウェルを残します。 注：硬化したときエラストマーは、タッチにしっかりと乾燥しているべきです。 （2部の安息香酸ベンジルに1部のベンジルアルコール）BABB溶液を調製します。これは、ガラス瓶に保存され、光から保護されるべきです。 注意：BABBは、毒性、腐食性溶液です。適切な防護服を着用しながら、ドラフトチャンバー内で処理します。 ガラスバイアル中 – （5ミリリットル1）50:50溶液を作製するためにBABBとメタノールを混ぜます。ホイルでバイアルをラップすることによって、 例えば 、光から保護します。 4.脱水、クリアと共焦点顕微鏡のためのハートの取り付け注：より大きなサンプルは、しかし、小さなサンプルのため、4ミリリットルのガラスバイアルにクリアすることができる（ 例えば、E13.5まで心）、顕微鏡皿に直接クリア処理を実行することをお勧めします。これがクリアされると心が非常に透明になるサンプルとして「負け」防止に役立ちます。これらの少量のサンプルをクリアするため、数分以内に起こる、非常に迅速です。 注：ホイルでチューブや食器をカバー/ラップすることにより、以下のすべてのステップの間に光から試料を保護します。 クリアする前に、部屋テンペで心を回転させることにより、メタノールの一連の免疫染色-心を脱水25％メタノール/ 75％PBS、50％メタノール/ 50％PBSおよび75％メタノール/ 25％PBS（各5分）：次の溶液の連続変化1.5 mlマイクロチューブでrature。最後に、100％メタノール中で3×5分間回転させます。 E13.5までの心のために、顕微鏡の皿の中央にある場所。顕微鏡下で心臓がその背側の最上部に配向していることを確認します。先の細いプラスチックパスツールピペットで心臓の周囲から任意のメタノールを除去。 きれいな先の細いプラスチック製パスツールピペットを使用して、BABBを追加：メタノール50:50ソリューションを心没頭するのに十分な量で（約300から400μl）を。心は時々溶液中で裏返しにすることができますように心はまだ不透明である一方で、再び向きを確認してください。 5分間溶液中に残します。 ドラフト内でガラス廃棄ボトルへ50:50溶液を除去し、再び先の細いプラスチック製パスツールピペットを使用して、BABBと交換してください。 注：大容量を必要としません。 suffを追加icient心は溶液の液滴内に位置するように。心臓は5分以内にクリアする必要があります。 大きい方の心のために、ガラスバイアル内のサンプルをオフにします。 注：E15.5の心臓は、30分〜1時間以内にクリアする必要がありますが、必要に応じて一晩放置することができます。 サンプルがクリアされている後、溶液を除去し、BABBの最小容積と交換してください。必要に応じて、所定の位置にそれを維持するのに役立つように、カバースリップでサンプルをカバーし、しかし、これは絶対に必要というわけではありません。イメージングのために心を使用してください。 5.イメージングは​​、共焦点顕微鏡によって心をクリア注：画像は、10倍または20倍のドライ対物レンズを使用して、倒立型共焦点顕微鏡で撮影しました。それは直立共焦点に食器を使用することも可能ですが、余分なケアはBABB溶液と対物レンズの接触を避けるようにしなければなりません。 心臓15のzスキャンを収集します。心臓の大きさに応じて、タイルのスキャンは、全体の心臓16の画像を必要とすることができます。 <br/> 注意：BABBは、腐食性溶液で清潔な手袋を着用し、顕微鏡皿の外側はBABBから自由であることを確認してください。慎重に皿を処理し、顕微鏡上に漏出事故の危険性を最小限にするために皿に蓋を保ちます。 客観的な作動距離が許せば、関心領域の高解像度画像を得るために高倍率を使用しています。 フィジーソフトウェアの使用6.データ解析フィジー17内の画像のzスタックを開きます。 それのスタック全体または一部のAZ投影を行うには、画像をクリックして、スタックを選択し、Zプロジェクトが続きます。開始と停止スライス番号を入力し、zの投影の種類を選択し、 例えば、平均強度、最大強度。 （プラグインのメニュー選択セグメンテーションから、次に/なげなわツールをブロー）フェラ・ツールを使用して画像スライスのスタック内の個々の容器をハイライト表示し、EAに充填される画像の領域をクリックしますchのスライス。 （色と前景色が続き、[オプション]を選択し、[編集]をクリックします）選択の前景色で選択領域を埋めるために（そして、塗りつぶしを選択し、[編集]をクリックします）塗りつぶしコマンドを使用します。 画像は以前のようにスタックZプロジェクト。 IMARISを使用して生成された冠動脈の7. 3D表面ボリュームレンダリング画面上部のサーパスビューアイコンをクリックし、ドラッグして、データウィンドウに画像ファイルをドロップします。画面の上部にある3Dビューのアイコンをクリックしてください。 表面アイコン（青いアイコン）を選択し、[作成]タブをクリックします。 「自動作成をスキップし、手動で編集」ダイアログ・ボックスをクリックして、描画アイコン（薄い鉛筆のアイコン）をクリックしてください。 等高線]タブを選択し、[モード]タブ。モードでは、魔法の杖や孤立線のアイコンをクリックしてください。 [選択]の横のをクリックして、画面の右側にポインタ選択のポインタモードを選択し、「描画をクリックしてください9; （画面の左下にある）ボックス。 連続したスライスにおける動脈の輪郭を選択するために、孤立線や魔法の杖ツールを使用してください。スライス位置のスライダーを使用してスライスするスライスから移動します。 すべての輪郭が選択された場合には、サーフェスの作成ボックスをクリックしてください。周囲のボリュームが非表示になり、またはブレンドモードを使用して、多かれ少なかれ不透明にすることができます。モード]タブに続いて、それを強調表示し、[設定]タブを選択するために、ボリュームをクリックしてください。ブレンドを選択し、不透明度を変更するには、スライダを使用しています。 スナップショット機能を使用して画像をキャプチャします。