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유전학

표면 식민지 미생물 집단에 공간 분리를 모니터링

Published: October 29, 2016
doi:
10.3791/54752
, , , , , ,
1Terrestrial Biofilms Group, Institute of Microbiology,Friedrich Schiller University, Jena

Summary

진화 시나리오되지만 (공간적 분리)의 역할은 공간 분포의 조정을 허용하는 제어 실험실에서 미생물 단순한 시스템을 사용하여 조사 할 수있다. 설립자 셀 밀도를 수정하여, 다양한 구색 수준은 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)의 식민지 바이오 필름에 형광 표지 된 박테리아 균주를 사용하여 시각화 할 수 있습니다.

Abstract

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.

Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.

Introduction

지난 수십 년 동안, 미생물은 지구 1, 2에 다양한 생태계와 관련된 소셜 커뮤니티로 인식되고있다. 일반적인 실험 실시에 사용될 플랑크톤 배양 달리, 환경 미생물 생태 설정에 따라 공간적 커뮤니티 구조의 다양한 범위를 나타낸다. 간단한 미생물 시스템은 3,4- 사회적 상호 작용의 전개에 대한 공간 구조의 결과를 이해하는 데에 이용 될 수있다. 모두 진핵 및 원핵 모델 시스템을 사용하여 마지막 2-3년 출판물 미생물 개체군 5-8 내의 협력 안정성 공간 구조의 영향을 강조했다. 또한, 또한 상호 작용 파트너 9-11의 공간 분포를 변경할 수 있습니다, 예를 들면, 미생물 중 대사 교차 공급을 상호 작용을 의무. 이러한 연구에서 공간 구조의 영향은 대부분 너무 거주 표면 부착 고착 세포를 이용하여 조사-called 바이오 필름 또는 식민지에서 한천 배지의 표면에 성장합니다. 높은 공간 구색의 결과 유전 적 부동은 미생물의 식민지에서 관찰 할 수있는 특정 클론 linages (12)에 대한 높은 지역 고정 확률의 원인 유전자 병목의 시리즈에서 세포 분열 매개 확장 결과의 가장자리에 영양 고갈. 유전 드리프트 따라서 미생물 콜로니에서 분리 공간의 역할을 조사하기 위해 이용 될 수있다.

환경에서 바이오 필름은 자체 제작 고분자 매트릭스 (13)에 의해 둘러싸여 multispecies 커뮤니티입니다. 생물막 구조, 기능 및 안정성이 박테리아 교환 신호, 매트릭스 성분과 자원, 또는 공간을 위해 경쟁하고 독소와 항생제를 사용하여 영양소. 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)이 높은 조직 개발합니다 주거 및 루트 식민지 박테리아 토양 인 사회적 상호 작용의 복잡한 네트워크에 의존 생물막 사회 14. 소셜 유사곤충, B. 서브 틸리 세포는 세포 외 매트릭스 생산자와 식인종, 운동성 세포, 휴면 포자와 다른 세포 유형 (15, 16)의 개체군을 개발, 노동 전략의 사업부를 사용합니다. 분화 과정은 동적 환경 조건 (17, 18)에 의해 변경 될 수있다.

세균에 의한 표면 식민지의 전략은 쉽게 성장 배지에 한천 농도를 수정하여 실험실 조건에서 조작 할 수 있습니다. 반 고체 한천 (0.7-1 %의 한천)이 편모 중심의 사회가 19 ~ 21를 집단이라고, 확산을 용이하게하면서 낮은 한천 수준 (0.2-0.3 %)에서, 활성 편모를 은닉 박테리아, 수영을 할 수 있습니다. 편모가없는 특정 균주는 엑소 폴리 사카 라이드 매트릭스 및 기타 분비 hydrophobin 화합물 22-24에 의해 용이하게, 즉 성장 의존 인구 확장을 통해 슬라이딩 반고체 매체를 통해 이동할 수있다. 마지막으로, capabl 박테리아있는하드 한천 배지 (1.2-2 %) 14,17,25에 바이오 필름 개발 형태 구조적으로 복잡한 식민지의 전자. 이러한 특성은 정확하게 자연 서식지에서의 조건을 조절하여 실험실에서 시험 동안이 표면 확산 전략 다른 환경 조건 (26)에 따라 점차 하나로부터 수신 할 수 있습니다. 단일 셀 기반 운동성은 그람 양성 및 -negative 모두 세균 27 B. 복잡한 콜로니 생물막의 공기 – 액체 계면에서 생물막 발전 개시시 중요하지만 서브 틸리는 편모 운동성 (28)의 삭제의 영향을받지 않습니다. B.의 개발 과정 그러나, 공간 조직 서브 틸리 콜로니 생물막은 생물막 8을 초기화하는 데 사용되는 세균 접종의 밀도에 의존한다.

여기, 우리는 B를 사용 서브 틸리 표면 식민지 기간 동안 공간 분리는 인구 수준 motili의 메커니즘에 의존한다는 것을 보여타이 (즉, 집단 또는 슬라이딩), 및 식민지 생물막 개발은 설립자의 세포 밀도에 따라 달라집니다. 우리는 지속적 매크로 스케일에서 미생물의 생물막의 성장 표면과 정착되지만 모니터링에 적용될 수있는 형광 현미경 도구를 제시한다. 또한, 정량 방법은, 모집단의 상대적인 풍부함 변형을 결정하기 위해 제시된다.

Protocol

문화 미디어, 반 고체 한천과 바이오 필름 판, 전 문화 1. 준비 집단 및 슬라이딩 중간 준비 레녹스 브로 쓰 (LB) 2 g, 120 ° C에서 20 분 동안 100 ml의 이온 교환 수에 한천 압력솥 0.7 g을 녹인다. 실험 간의 재현성을 향상시키기 위해 소량 (50 ~ 200 ml)에 사용합니다. 즉시 멸균 후, 적어도 2 시간 동안 55 ° C의 배양기에서 증발 장소를 줄일 배지 병의 뚜껑을 닫는다. 매체 온도를 55 ° C로 단련 된 후, 실험실 멸균 후드 아래에 90mm 직경의 폴리스티렌 페트리 접시에 20 ㎖ 한천 LB 배지를 붓는다. 시간 경과 실험을 위해, 35mm 직경의 폴리스티렌 페트리 접시 당 5 ml의 한천 LB 배지를 붓는다. 즉시 주입 후 배양 접시를 닫고 서로의 상단에는 4 개 이상의 판을 적층하지 않고 한천 배지는 적어도 1 시간 동안 응고하자. 2xSG 중간 P식민지 바이오 필름에 대한 배상 영양 브로스 1.6 g, 0.2 g의 KCl, 황산 0.05 g 7H 2 O, 120 ° C에서 20 분 동안 100 ml의 이온 교환 수에 한천 압력솥 1.5 g을 녹인다. 실험 간의 재현성을 향상시키기 위해 소량 (50 ~ 200 ml)에 사용합니다. 즉시 멸균 후, 적어도 2 시간 동안 55 ° C의 배양기에서 증발을 감소시키고 용기를 배치 배지 병의 뚜껑을 닫는다. 유체 온도가 자동 조정 55 ° C로 후 1M 칼슘 멸균 0.1 ㎖의 필터를 추가 (NO 3) 2 용액 0.1 ml를 필터는 0.1 ml를 필터 1mM의 다음날에 FeSO4 용액, 0.5 ㎖의 멸균 100mM의 MnCl 2 용액을 멸균 살균 20 % 포도당 용액. 실험실 멸균 후드, 90mm 직경의 폴리스티렌 페트리 접시 당 20 ㎖ 한천 2 배 SG 매체를 붓는다. 시간 경과 실험을 위해, 35mm 직경의 폴리스티렌 페트리 접시 당 5 ml의 한천 LB 배지를 붓는다. 클즉시 주입 한 후 배양 접시를 전자 서로의 상단에 접시를 쌓아하지만, 이상 4 판, 그리고 한천 배지 적어도 1 시간 동안 응고 수 있습니다. 스타터 문화의 준비 참고 : B. 서브 틸리 스 (168)는, 구조적으로 설명 된 방법에 사용 된 유도체 NCIB 3610 균주는 녹색 또는 적색 형광 단백질을 생산하고 8,27 전에 설명 하였다. 균주는 -80 ° C 냉장고에 정기적으로 저장됩니다. 3 ㎖ LB 배지에서 -80 ° C 주식에서 스타터 문화를 접종 및 수평 진동 (225 RPM)와 37 ° C에서 (16 ~ 18 시간)을 밤새 품어. 야생 B.의 분리로 18 시간보다 더 오래 문화를 배양하지 마십시오 서브 틸리 집계 및 테스트 튜브에 생물막을 형성하는 대부분 쉽다. 표면에 대한 찬란 레이블 된 박테리아 균주 2. 공동 접종 확산 집단 세미 – 고체 한천 플레이트의 건조 및B.의 슬라이딩 서브 틸리 스. 진을 치고 전에 접종에 20 분 동안 슬라이딩 마른 한천 플레이트. 층류 후드에서 발견 드라이 플레이트 (도 1 참조). 참고 : 세균 득시글 거리는 슬라이딩은 반 고체 한천 배지의 건조에 따라 달라집니다. 부족 건조 편모 매개 수영의 결과로 한천 배지에 물 축적 할 수 있습니다. 득시글 거리는 부족에 장시간 건조 시간 결과. 그림 1 :.. 실험 워크 플로우 일반적인 절차는 (에서 왼쪽에서 오른쪽으로) 판, 접종 및 형광 현미경 감지 건조, 배양 배지의 준비를 포함하여, 그림에 묘사되는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 공동 접종집단 및 슬라이딩에 대한 세균 배양의 600 nm에서 밤새 스타터 문화의 광학 밀도를 결정하고 B의 밀도 정규화 된 녹색과 빨간색 형광 단백질 생산 균주를 혼합 서브 틸리 NCIB 3610 또는 1.5 ml의 반응 관에서의 Δ의 노파 유도체. 예를 들어, 온화하게 변형 2. 소용돌이 (최대 속도에서 3 초)의 μL ([변형 2의 하룻밤 문화의 OD 600] / 100 * [변형 1의 하룻밤 문화의 OD 600])에 대한으로 변형 한 100 μl를 혼합 균일 한 분포. 참고 : B. 자신의 Δ의 노파 유도체가 슬라이딩에 사용되는 동안 서브 틸리 NCIB 3610 균주가 득시글 거리는을 관찰 접종한다. 스팟 미리 건조 판의 중앙에 혼합 배양 2 μL (도 1 참조) 또한, 접종 후 10 분 동안 플레이트를 건조. 37 ° C에서 접시를 품어 과잉 수분이 뚜껑에 아닌 한천 표면에 응축 할 수 있도록 수직입니다. <BR /> 참고 : B의 배양 시간 서브 틸리 득시글 거리는은 8-16 시간 사이에 일반적입니다. 일반적으로, 떼의 가장자리는 8 시간에 90mm 페트리 접시의 측면에 도달한다. 슬라이딩은 느린 과정 및 배양 적어도 16-42 시간이 필요합니다. 36 시간 후, 전방 슬라이딩는 90mm 배양 접시의 측면에 도달한다. 시간 경과 실험을 위해, 37 ° C로 설정 예열 단계 배양 챔버에서 35 mm 직경 배양 접시를 놓습니다. 페트리 접시의 뚜껑이 실험 기간에 걸쳐 제거 남아 있는지 확인합니다. 인큐베이터의 상단에 수분 형성을 회피하기 위해 40 ° C로 무대 인큐베이터의 커버를 설정합니다. 다른 초기 세포 밀도와 찬란 레이블 된 박테리아 균주 3. 공동 접종 B.의 식민지 biofilm 형성을위한 한천 플레이트의 건조 서브 틸리 스. 층류에서 커버하지 않고 식민지 바이오 필름 개발을위한 판을 건조이전에 접종을 15 분 동안 후드. 참고 :이 증가 습도, 수영 또는 득시글 거리는이 부족 건조 결과는 29 가능할 수있다. 작은 생물막 식민지에서 너무 오래 결과를 건조. 식민지 바이오 필름에 대한 10 배 희석 스타터 문화의 준비 B.의 하룻밤 스타터 문화를 생산하는 녹색과 빨간색 형광 단백질의 100 μl를 혼합 균일 분포 1.5 ml의 반응 관에서 서브 틸리 스 168 가벼운 와류. LB 배지에서 10 배 희석 시리즈를 준비합니다. 희석되지 않은 10 1 10 (2)의 스폿이 μL, 103, 생물막 유도 배지를 함유하는 플레이트에 104 희석 혼합 배양. 참고 : 6 ~ 9 생물막 식민지 식민지가 서로 동일한 거리에 분리되어 있음을 고려하여 하나의 90mm 페트리 접시에 시작할 수 있습니다. 30 ° C에서 접시를 품어 과잉 수분이 뚜껑에 응축 할 수 있도록 똑바로 세워하지 한천 표면에. 주 : B.위한 배양 시간 서브 틸리 바이오 필름은 3-1 사이의 일입니다. 일반적으로, B의 식민지 생물막 서브 틸리 2 일에 평균 크기와 복잡한 구조를 도달한다. 시간 경과 실험을 위해, 35 mm 직경의 페트리 접시의 중앙에 하나의 균액을 배치하고, 30 ℃로 설정된 예열 단계 배양 챔버에서 접시를 놓는다. 페트리 접시의 상단이 실험 기간에 걸쳐 제거 남아 있는지 확인합니다. 인큐베이터의 상단에 수분 형성을 회피하기 위해 35 ° C로 무대 인큐베이터의 커버를 설정합니다. 레이블 된 균주 4. 형광 현미경 검출 영상 장비 설명. 표면 식민지와 형광 신호를 검출하기 위해, 0.5X PlanApo 목표를 장착 한 전동 형광 스테레오 줌 현미경 (자료 표에 대한 자세한 목록 참조)를 사용하여, 두 개의 LED가콜드 – 광원 (형광 검출을위한 하나는 가시 광선에 대해 하나), 필터 세트 (629)에서 GFP (여기 40분의 470의 나노 및 배출 50분의 525 ㎚에에서) 25분의 572 ㎚에와 MRFP (여기 및 방출에 대한 / 62 ㎚) 및 높은 해상도 흑백 카메라. 멀티 채널 및 시간 경과 모듈을 포함 스테레오 줌 현미경에 사용할 적절한 소프트웨어와 이미지 수집 및 처리를 수행합니다. 시간 경과 실험을 위해, 어댑터와 스테레오 줌 현미경에 장착 된 표준 가열 단계 인큐베이터를 사용합니다. 집단 및 슬라이딩 확장의 영상 90 밀리 판의 가장 큰 가능한 영역을 캡처하는 가장 낮은 배율을 사용합니다. 반경 세균 확장과 형광을 모니터링하기위한 눈에 보이는 필드의 모서리에 접종의 기원합니다 (90mm 페트리 접시의 중간)을 설정합니다. 형광 신호의 세기에 따라 최적의 노출 시간을 조정한다. 참고 : 구조적으로 expre 들어B.에서 ssed 형광 유전자 녹색 서브 틸리 1.5 3 초의 노출 시간으로 적색 형광을 각각 사용할 수있다. 또한, 10 msec의 노출 시간은 가시광에 적합하다. 전체 생물막 콜로니의 검출을 가능 배율을 사용하여 시야의 중앙에 콜로니를 조정한다. 주 : 집단 및 확장 슬라이딩으로 최적 노출 시간은 생물막 콜로니의 형광 신호를 검출하기 위해 형광 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준에 따라 달라진다. 아래의 대표적인 결과를 들어, 녹색과 빨간색 형광은 각각 1, 3 초 노출 간격을 사용하여 검출되었다. 시간 경과 영상의 경우, 일정 노출 시간을 사용하여 특정 간격으로 이미지를 얻을 수 있습니다. 정량적 데이터 해석 ImageJ에 소프트웨어에 의해 인식되는 파일 형식으로 형광 실체 녹화 된 영상을 저장한다. 5. 날엔분석 각각 다르게 표시 형광 변형의 점유 면적을 분석하기 위해, BioVoxxel 플러그인과 확장 ImageJ에 소프트웨어에 대한 관심의 파일을 엽니 다. 옵션 만 선택하고, "오토 스케일", "모든 시리즈를 열고"여기서 "바이오 형식 가져 오기 옵션"라는 창이 나타나면 "OK"를 클릭하여 파일을 엽니 다. 참고 :이 파일은 세 가지 이미지, 현미경 (녹색, 적색 형광 밝은 필드 이미지)에서 이미지를 기록하는 데 사용되는 각 채널에 대한 하나의 스택으로 표시됩니다. "스택"- – "이미지"를 선택하여 개별 채널 이미지로 스택을 별도로 ImageJ에 제어판에서 "이미지에 스택". 참고 : 이미지가 나타나지 1/3 (녹색 채널)로 번호가 매겨집니다, 2/3 (적색 채널)과 3/3 (시야). 여기서, 시야 화상은 분석에서 제외된다. 이미지를 분석하는, 선택하는 8 비트 영상으로 각각 변환"이미지"- "유형"- "8 비트". "스케일 설정"- 화소 (2)의 점유 면적을 확인하려면, "분석"을 사용하여 이미지의 크기를 다시 설정합니다. 윈도우가 다른 스케일 옵션을 뜨면, "스케일 제거를 클릭하십시오"를 선택하여 규모를 재설정합니다. 열려있는 모든 이미지 스케일을 제거하는 옵션 "글로벌"을 확인하십시오. 배경을 제거하려면 ImageJ에 제어판에서 "타원형"도구를 사용하여 형광 영역 외부의 타원 영역 (관심 지역, ROI)을 그립니다. 배경 타원의 크기는 분석 된 모든 화상에 대해 동일한 것을 보장하기 위해, 키보드의 [t] 문자를 통해 ROI 관리자에 추가. "저장"옵션 – 배경 타원형 ROI가 "추가"를 통해 저장할 수 있습니다 어디에 투자 수익 (ROI) 관리자 창이 나타납니다. "측정"- 배경 타원형 ROI가 이미지에 표시되는 경우, "분석"을 선택하여 영역의 강도를 측정한다. 참고 : 결과다른 사람의 사이에 평균 형광 강도가 "평균"열에서 표시되는 위치 창이 나타납니다. "수학"- – "빼기"및 측정 값을 삽입 "프로세스"를 클릭하면 배경 타원형 투자 수익 (ROI)을 선택 해제하여 이미지에서 평균 배경 형광 강도의 값을 뺍니다. "조정"- – "임계 값"옵션 "영상"을 통해 이미지에 임계 값을 적용합니다. 방법 오츠와 흑백 (B & W)를 선택합니다. 은 "어두운 배경"옵션을 선택하고 "적용"을 클릭하여 임계 값을 사용한다. 참고 : 임계 값은 검은 색으로 표시됩니다 아래의 임계 값 이상의 영역이 흰색과 것을 알 수있다 이진 이미지를 이미지로 변경됩니다. "입자를 분석"옵션 -은 "분석"을 통해 임계 값 이상의 모든 것을 선택합니다. 설정에 창에서 기본 옵션을 유지하고 "S를"결과 표시 "를 유지하고ummarize 총 면적 ","결과 창에서 요약 및 표시 표시된 열에서 차지하는 영역을 표시하기 위해 "OK"선택 옵션.를 클릭하십시오. "

Representative Results

세균 집단의 실험실 시스템은 생태 나 진화 질문을 탐구하는 매력적인 접근 방식을 제공합니다. B.의 다음 세 가지 표면 식민지 모드 서브 틸리는 인구 구색의 모양을 검사하는 데 유 전적으로 동일한의 분리를 즉,하지만 긴장을 찬란 다른를 표시했다. B.의 편모 종속 집단 표면 이동 인 집단 서브 틸리 스, 고도의 혼합 인구의 결과. 이 진을 치고 식민지에서 식민지 영역이 중복 된 녹색과 빨간색 형광 박테리아는 (그림 2A 참조). 빠른 표면 식민지는 시간 (비디오 그림 1)에 따라 할 수있다. B 서브 틸리 집단 중에 세포의 박층 인큐베이션 몇 시간 후 접종 중심에서 확장 (도 2b 참조). 4752 / 54752fig2.jpg "/> 그림 2 : B의 확장을 치고 . 접종 전 1 : 서브 틸리 진을 치고 식민지는 1을 혼합 한 녹색과 빨간색 형광 균주가 포함되어 있습니다. (각각 GFP 및 RFP) 15 시간의 녹색과 빨간색 형광 후 (A)은 적절한 형광 필터를 검출되었다. (B) (B)의 득시글 거리는 박층 이미지 서브 틸리이 비디오 그림 1. 스케일 바 = 5mm에서 추출 선택한 시점에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그러나, B. 기능 편모이 부족하지만 생산 엑소 폴리 사카 라이드, hydrophobin 및 surfactin의 도움으로 확산 할 수있다 서브 틸리 스 균주가, 반 고체 한천 배지에 발견하고는 다르게 표시된 균주는 특정 데프에서 분리이네 부문 (그림 3A 참조). 슬라이딩 콜로니의 개발은 (도 3B 또는 비디오도 2 참조)의 시간에 기록 할 수있다. 그림 3 : B.의 식민지 슬라이딩 . 접종 전 1 : 서브 틸리 식민지는 1을 혼합 한 녹색과 빨간색 형광 균주가 포함되어 있습니다. (각각 GFP 및 RFP) 24 시간의 녹색과 빨간색 형광 후 (A)은 적절한 형광 필터를 검출되었다. (B)가 B의 이미지 디스크를 슬라이딩 서브 틸리이 비디오 그림 2. 스케일 바 = 5mm에서 추출 선택한 시점에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 득시글 거리는와 SLI의 구색 수준 동안땡 확대 식민지를 수정할 수 없습니다, 식민지의 생물막에서 다르게 표시 형광 균주의 공간 분리가 시작 세포 밀도에 의해 영향을받을 수 있습니다. 때 B.의 식민지 생물막 서브 틸리가 혼합 된 인구의 높은 세포 밀도로 시작되었으며, 녹색과 빨간색 형광 균주는 작은 보였다 또는 어떤 공간 구색 (그림 4 참조). biolfilm을 시작하는 세포 밀도가 낮은 반면에, 맑은 녹색과 빨간색 형광 부문은 형광 현미경에 의해 검출 될 수있다. 구색 수준은. 비디오 그림 3과 4는 접종 균주의 최저 및 최고 희석 식민지 확장을 제시 생물막 시작 인구의 희석 수준에 명확하게 의존했다. 그림 4 : B의 식민지 바이오 필름의 구색 수준 에서 서브 틸리. (: 각각 문화를 개시 희석 105 배 희석되지 않은 아래에 위의) 다양한 초기 세포 밀도는 녹색과 빨간색 형광 균주의 콜로니 바이오 필름은 다른 초기 세포 밀도로 접종 이일 후에 표시됩니다. 스케일 바 = 5 mm이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 녹색 및 적색 형광 균주의 비율은 상기 실험에 사용되는 균주의 인구 구조 및 경쟁력 정량적 특성을 허용 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 정량화 할 수있다. 비디오 그림 1 : 시간 경과 IMAG득시글 거리는 (B)의 에스 서브 틸리 1로 초기화 :. 녹색과 빨간색 형광 균주의 1 믹스 (오른쪽 다운로드를 클릭하십시오.) 비디오는 10 시간의 시간 과정을 보여줍니다. 스케일 바 = 7mm. 비디오 그림 2 : B. 슬라이딩 시간 경과 이미지 서브 틸리 1로 초기화 :. 녹색과 빨간색 형광 균주의 1 믹스 (오른쪽 다운로드를 클릭하십시오.) 비디오는 24 시간의 시간 과정을 보여줍니다. 스케일 바 = 5 mm이다. 비디오 그림 3 : B.의 시간 경과 이미지 녹색의 1 혼합 : 서브 틸리 식민지 생물막은 1 개시-. 높은 세포 밀도에서 붉은 형광 균주 (오른쪽 다운로드를 클릭하십시오.) 비디오는 48 시간의 시간 과정을 보여줍니다. 스케일 바 = 5 mm이다. 비디오 그림 4 : B.의 시간 경과 이미지 낮은 세포 밀도에 녹색과 빨간색 형광 균주의 1 믹스 : 서브 틸리 식민지 생물막은 1로 시작했다. (오른쪽 다운로드를 클릭하십시오.) 비디오는 48 시간의 시간 과정을 보여줍니다. 스케일 바 = 5 mm이다.

Discussion

박테리아 형광 도구의 이용은 이종 유전자 발현과 단백질 30,31 지역화 (32)의 연구뿐만 아니라 인구 (8) 내의 변형의 공간적 분포의 분석뿐만 아니라 용이하게한다. 충분히 다른 여기 및 방출 파장의 형광 마커는 명확하게 혼합 할 때, 그렇지 않으면 서로 구별이 균주를 현지화 할 수 있습니다. 기술 된 프로토콜은 균주 또는 종의 혼합 배양 인구 역학 예 경쟁 실험 또는 상승 효과를 관찰하는 데 이용 될 수있다. 의 형광 혼합 집단에서 균주 표시된 상대 존재비를 결정하는 기능 부착 슬라이딩 득시글 거리는, 또는 생물막 콜로니 표면에 한정되지 않고, 침지 포함 또한 셀 또는 공기 중 인터페이스 흐름 다른 다세포 생물막 시스템에 사용될 수있다 27,33-35를 생물막.

_content "> 제시된 기술 균주 디자인 경쟁 실험의 공간 분포를 검출하는 강력한 도구이지만, 또한 확장 콜로니 유전자 발현 얼룩이 다음 수있다. 여기에서 설명하는 배양 조건 B. 서브 틸리와의 팽창의 정확한 매개 변수 적용 한천 매체는 다른 종 또는 균주 (20)에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다. 배양 챔버에서 샘플을 배치 영상이 시간에 인구 역학을 수행하기 위해 실험을 허용하는 동안주의를 배양하는 동안 실내의 습도 수준을 부여해야하지만.

균주가 서로 구별 될 수있는 형광 마커를 발현하도록 여기에서 설명 된 기술은 또한 시험 균주의 유전 적 변형을 요구한다. 또한, 별개의 여기 및 발광 스펙트럼을 갖는 게다가,이 두 선택 형광 마커 유사한 정량적가 것을 권장음 수익률과 유사한 수준으로 표현된다 (방출되는 흡수 된 광자의 예 비). 또한, 시간에 상대 강도의 변화를 측정 할 수 있고, 실험의 초기 시간 포인트 정규화. 상대적인 증감이어서 다른 양자 효율이 서로 다른 형광 물질 사이에 비교 될 수있다. 제시된 실험 시스템의 경우, 다른 적색 및 녹색 형광 단백질 B. 검출 할 수있는 최적의 형광 쌍을 선택하기 이전에 (36, 37)를 시험 하였다 서브 틸리 스. 최적 노출 시간은 각각 형광 단백질 시료에 대해 결정되어야한다. 특정 세포 밀도 또는 세포의 여러 층 인구에서 효율적으로 신호를 검출해야 할 것이다. 특정 형광 단백질로 인해 비효율적 인 표현 및 / 또는 단백질의 번역 및 따라서 낮은 양자 수율의 박테리아 세포에서 낮은 농도가있을 수 있습니다. 이러한 비효율적 인 형광 마커 수 연구시스템의 감도를 끌어 내고 그리고 아마도 여기 광에 의해 세포 독성을 초래하는 균주를 검출하기 위해 필요한 시간이 연장된다. 형광 강도는 형광 리포터 따라 코딩하는 유전자를 발현하기 위해 사용되는 프로모터를 변경함으로써 변경 될 수있다. 너무 높은 발현 수준은 세균에 대한 해로운 적당 비용 이어지는 형광 단백질의 불필요한 과잉 생산 될 수있다. 경쟁 실험을 수행 할 때, 하나의 셀에 특정 형광 단백질 생산의 비용을 고려한다. 형광 마커 경쟁 균주 또는 위치를 자신의 형광 표지 만 다른 두 개의 동종 균주가 서로 경쟁하는 사이에 교환되는 제어 실험은 항상 하나의 마커를 향해 어떤 편견을 결정해야합니다. 세포 내 단백질의 형광 수명은 측정 강도에 영향을 미칠 수있다. 특정 박테리아 종의 첨가에서, 형광도의는 여기에 설명 된 이외의 다른 형광 마커의 사용이 필요할 수 있습니다.

정확하게 구별 균주의 공간적 분포 및 존재비를 결정하기 위해 상기 제 형광 마커 반대로위한 형광 필터를 사용하는 동안 상기 제 형광 단백질로부터 유래하는 배경 신호를 개별적으로 하나의 표시를 생성하는 박테리아를 함유하는 (단종 샘플에 대해 테스트되어야 ). 이것은 형광 신호 강도 겹치는 감산을 허용한다. 실체가 팽창 콜로니로부터 상기 형광 신호를 기록으로 중요한, 제시된 프로토콜은 두 차원 공간 배치를 결정하는 것이 편리하다. 확대 세균 집단의 구조 (즉, 주름 같은 구조가 높은 지역 형광 강도를 표시하는 이상의 셀을 포함 할 수 있습니다) 다양한 형광 수준이 발생할 수 있습니다. 따라서, 이미지의 설명 분석 거라고공간적 분포가 아니라 특정 위치 내에서 균주의 풍요 로움을 etermines. 이전 프로토콜은 세균 콜로니 (38)에 인구 역학의 20 형광 이미징을 집단에 대한 샘플 준비를 설명하지만, 우리의 프로토콜은 이러한 기술을 결합한다. 인구 구조의 3 차원 해상도 (예를 들어 공 초점 레이저 주사 현미경 (39, 40) 또는 구조화 조명 현미경 41)의 관찰을 허용하고 현미경 기술은 구조적 복잡성 증가와 시료에 적용 할 수있다. 이러한 추가 기술은 실체 현미경을 사용하여 사용할 수 없습니다 균주 (31)의 단일 세포 기반 검색을 지원합니다.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 독일 연구 협회 (DFG)에서 부여 KO4741 / 3-1에 의해 투자되었다. 또한, Á.TK의 실험실은 마리 퀴리 Skłodowska 경력 통합 보조금 (PheHetBacBiofilm)에 의해 지원 및 DFG에서 KO4741 / 2-1을 부여했다. TH, AD, RG-M., 및 EM은 각각 국제 막스 플랑크 연구 학교, 알렉산더 폰 훔볼트 재단, Consejo 나시 오날 드 Ciencia y를 TECNOLOGIA 독일 학술 교류 서비스 (CONACYT-DAAD)와 JSMC의 연구비에 의해 지원되었다.

Materials

Lennox Broth (LB) Carl Roth GmbH X964
Agar-agar, Kobe I Carl Roth GmbH 5210
Petri dish (90 mm diameter) any NA Use Petri dishes without ventillation cams
Petri dish (35 mm diameter) any NA Use Petri dishes without ventillation cams
Difco Nutrient Broth BD Europe 234000
KCl any NA
MgSO4 7H2O any NA
Ca(NO3)2 4H2O any NA
MnCl24H2O any NA
FeSO4 any NA
D-Glucose any NA
Fluorescence AxioZoom V16 time-lapse microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH see bellow detailed description
AxioZoom V16 Microscope body Carl Zeiss Microscopy GmbH 435080 9030 000
Phototube Z 100:0 for Axio Zoom V16 Carl Zeiss Microscopy GmbH 435180 9020 000 without eyepieces
Fluar Illuminator Z mot Fluorescence intermediate tube for Axio Zoom.V16 Carl Zeiss Microscopy GmbH 435180 9060 000
Controller EMS 3 Carl Zeiss Microscopy GmbH 435610 9010 000
System Control Panel SYCOP 3 Carl Zeiss Microscopy GmbH 435611 9010 000
Reflector module Z Carl Zeiss Microscopy GmbH 435180 9160 000 For Fluar Illuminator Z mot on Axio Zoom.V16 and SYCOP 3
Filter set 38 HE eGFP shift free (E) Carl Zeiss Microscopy GmbH 489038 9901 000 EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50
Filter set 63 HE mRFP shift free (E) Carl Zeiss Microscopy GmbH 489063 0000 000 EX BP 572/25, BS FT 590, EM BP 629/62
Mount S Carl Zeiss Microscopy GmbH 435402 0000 000
Objektive PlanApo Z 0,5x/0,125 FWD 114mm Carl Zeiss Microscopy GmbH 435280 9050 000 164mm parfocal length; M62x0.75 thread at front
Coarse/fine drive with profile column Carl Zeiss Microscopy GmbH 435400 0000 000 490 mm, 10kg load capacity, compatible with stand bases 300/450
Stand base 450 Carl Zeiss Microscopy GmbH 435430 9902 000
Cold-light source Zeiss CL 9000 LED CAN Carl Zeiss Microscopy GmbH 435700 9000 000
CAN-bus cable Carl Zeiss Microscopy GmbH 457411 9011 000 2.5 m length
Slit-ring illuminator Carl Zeiss Microscopy GmbH 417075 9010 000 d=66 mm
Flexible light guide 1500 Carl Zeiss Microscopy GmbH 417063 9901 000 8/1000 mm 
Illumination Adapter for light guide Carl Zeiss Microscopy GmbH 000000 1370 927
Lightguide HXP with liquid fill Carl Zeiss Microscopy GmbH 000000 0482 760 ø3mm x 2000mm
Camera Adapter 60N-C  Carl Zeiss Microscopy GmbH 426113 0000 000 2/3" 0.63x
High Resolution Microscopy Camera AxioCam MRm Rev. 3 FireWire Carl Zeiss Microscopy GmbH 426509 9901 000
AxioCam FireWire Trigger Cable Set Carl Zeiss Microscopy GmbH 426506 0002 000 for direct shutter synchronization
ZEN pro 2012 Carl Zeiss Microscopy GmbH 410135 1002 120 Blue edition, requires min. Windows 7 64-bit
ZEN Module Time Lapse Carl Zeiss Microscopy GmbH 410136 1031 110
Standard Heating Stage Top Incubator Tokai Hit INUL-MS1-F1
Zeiss Stereo Microscope Base Adapter Tokai Hit MS-V12
Softwares
Image J National Institute of Health, Bethesda, MD, USA v 1.49m
BioVoxxel plugin BioVoxxel http://www.biovoxxel.de/development/
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Spatial SegregationMicrobial PopulationsFluorescent MicroscopySwarmingSlidingBiofilm FormationSocial MicrobiologyFitnessImage AnalysisB. SubtilisLB MediumSwarming PlatesSliding PlatesColony BiofilmSG MediumGreen And Red Fluorescent ProteinOptical DensityMicroscopic TechniquesMicrobial Interaction

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Hölscher, T., Dragoš, A., Gallegos-Monterrosa, R., Martin, M., Mhatre, E., Richter, A., Kovács, Á. T. Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations. J. Vis. Exp. (116), e54752, doi:10.3791/54752 (2016).
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