在表面定植微生物种群监测空间分异

1.培养基，半固态琼脂和生物膜板，预培养物的制备中准备蜂拥及滑动溶解2克伦诺克斯肉汤（LB）和0.7g在100ml离子交换水中琼脂和高压釜的为在120℃20分钟。使用小体积（50-200毫升），以提高实验之间的重现性。 立即灭菌后，关闭介质瓶盖以减少蒸发和放置在55℃的培养箱中至少2小时。 介质的温度已经回火到55℃后，倒入20毫升琼脂LB培养基到实验室的无菌罩下的90mm直径的聚苯乙烯培养皿。时间推移实验，倒？35毫米直径的聚苯乙烯培养皿5毫升琼脂LB培养基。 关闭培养皿浇注后立即，堆叠在彼此的顶部不超过4板和让琼脂培养基固化至少1小时。 2xSG介质P赔偿殖民地生物膜溶解1.6克营养肉汤的将0.2g的KCl，0.05g的MgSO 4上的7H 2 O，和1.5g在100ml离子交换水中琼脂和高压釜的为在120℃20分钟。使用小体积（50-200毫升），以提高实验之间的重现性。 灭菌后，立即关闭介质瓶盖以减少蒸发，并将瓶在55℃培养箱中至少2小时。 介质的温度具有自调节到55℃后，添加0.1毫升过滤灭菌1M的Ca（NO 3）2溶液中加入0.1ml过滤除菌的100mM的MnCl 2溶液中加入0.1ml过滤除菌1mM的硫酸亚铁溶液，和0.5ml无菌的20％葡萄糖溶液。 在实验室无菌罩，每倒直径90mm的聚苯乙烯培养皿20毫升琼脂2倍SG网上平台。时间推移实验，倒？35毫米直径的聚苯乙烯培养皿5毫升琼脂LB培养基。 克洛斯e本培养皿浇注后立即，堆叠在彼此顶部的板，但不超过4板，并让琼脂培养基固化至少1小时。 发酵剂的制备注：B.芽孢杆菌 168，在下面组成中所述的方法中使用NCIB 3610衍生菌株产生绿光或红荧光蛋白和8,27之前进行了描述。菌株常规储存在-80℃冰箱中。 接种-80℃储存起始培养在3ml LB培养基，并在37℃下具有水平摇动（225转）孵育过夜（16-18小时）。不要孵化文化长于18小时野生B.分离株枯草大多容易发生聚集并形成在试管的生物膜。 将荧光标记的菌株2.联合接种面撒半固态琼脂平板的蜜蜂分群和干燥B.滑动枯草 。 干琼脂平板蜂拥和接种前滑动20分钟。在层流罩露出干板（ 见图1）。 注：细菌蜂拥和滑动依赖于半固体琼脂培养基的干。干燥不足使得导致鞭毛介导的游泳琼脂培养基上积水。延长干燥时间导致缺乏蜂拥的。 图1：实验工作流程中的常用的方法是在图中所示，包括准备培养介质，干燥板，接种和荧光显微镜检测（从左至右） 点击此处查看该图的放大版本。 共接种对于蜂拥及滑动细菌培养确定隔夜发酵剂培养物的光密度在600 nm和混合B.密度归绿光和红色荧光蛋白生产菌株枯草 NCIB 3610或在1.5ml反应管其ΔHAG衍生物。例如，对于应变2.轻度涡流（最大速度3秒）的微升（[菌株2的过夜培养物的OD 600] / 100 * [应变1的过夜培养物的OD 600]）为混合100μl的应变1的均匀分布。 注：B.枯草 NCIB 3610菌株接种到观察蜂拥，而它们的Δ 女巫衍生物用于滑动。 斑点2微升上的预干燥板的中间混合培养的（ 见图1），并进一步干燥所述板为接种后的10分钟。 在37℃下孵育板直立，以允许多余的水分凝结在盖而不是在琼脂表面。<BR />注：孵育时间为B.枯草蜂拥一般是8-16小时之间。一般地，群的边缘到达在8小时90毫米的培养皿的一侧。滑动是一个缓慢的过程，需要培养至少16至42小时。 36小时后，将滑动前达到90毫米的培养皿的一侧。 时间推移实验中，将35毫米直径的培养皿在预热阶段孵育室设置在37℃。确保在培养皿的盖保持在整个实验期间除去。舞台培养箱的盖设定为40℃至规避培养箱的顶部水分形成。 将荧光标记的菌株3.联合接种不同初始细胞密度琼脂平板B的殖民地生物膜形成的干燥枯草 。 干燥菌落生物膜发展板无盖在层流罩接种前15分钟。 注：增加湿度和游泳或蜂拥不足的干燥效果是可能的29。在干燥生物膜小殖民地太久的结果。 10倍稀释发酵剂培养菌落生物膜准备混合100微升绿光和红色荧光蛋白的生产B.过夜起始培养芽孢杆菌 168在1.5ml反应管中并温和涡旋均匀分布。准备在LB培养基中10倍稀释系列。 的未稀释或10 1，10 2斑点2微升，10 3，在含有生物膜诱导培养基平板10 4稀释混合培养。 注：6至9生物膜集落可以在单个90毫米培养皿考虑到的菌落以相等距离彼此分开启动。 在30℃下孵育板直立，以允许多余的水分凝结在盖和不是在琼脂表面。 注：孵育时间B.枯草芽孢杆菌生物膜是1天3之间。一般情况下，B的殖民地生物膜枯草达到在2天后的平均尺寸和复杂的结构。 时间推移的实验中，将单种菌在35毫米直径的培养皿的中央，并将培养皿在预热阶段孵育室设定在30℃。确保在培养皿的顶部保持在整个实验期间除去。舞台培养箱的盖设置为35℃至规避培养箱的顶部水分形成。 标记的菌株4.荧光显微镜检测设备描述成像。 为了检测表面殖民化和荧光信号，使用配有0.5X PlanApo目的电动荧光立体变倍显微镜（见材料表清单），两个LED冷光源（一个用于荧光检测，一个用于可见光），过滤器组的GFP（激发在四十零分之四百七十零nm，发射在五十零分之五百二十五纳米）和MRFP（激发在二十五分之五百七十二nm，发射在629 / 62纳米），和高分辨率单色相机。 与可用于立体变倍显微镜，包括多通道和时间推移模块相应的软件进行图像采集和处理。对于时间流逝的实验中，使用安装在与适配器立体声变焦显微镜标准加热阶段的孵化器。 和蜜蜂分群滑动扩展的影像用最低的放大倍率拍摄90毫米的钢板最大可能的区域。设置接种的原点（90毫米的培养皿的中间）至可见领域的监测径向细菌膨胀和荧光角球。 取决于荧光信号的强度调整最佳曝光时间。 注：对于组成expressed荧光基因B.枯草芽孢杆菌 ，绿光和红荧光为1.5和3秒的曝光时间，可以使用分别。此外，10毫秒的曝光时间是适当的可见光。 使用允许整个生物膜集落的检测放大率和视场的中间调整菌落。 注：对于蜂拥和滑动扩展，最佳曝光时间，以检测在所述生物膜集落的荧光信号依赖于荧光蛋白编码基因的表达水平。对于下面的代表性结果，使用1和3秒的曝光时间间隔，分别检测绿光和红光荧光。 对于时间推移成像，获取使用恒定的曝光时间以一定的间隔图像。 保存的文件格式的立体荧光图像的记录是由ImageJ的软件定量数据分析的认可。 5.逸一个分析分析由每个不同地标记的荧光应变占据的区域中，打开与一个BioVoxxel插件扩展中的ImageJ软件感兴趣的文件。 当一个名为“生物格式导入选项”窗口出现，其中仅选择“打开全系列”的选择和“自动定标”，单击“确定”打开该文件。 注：文件显示为三个图像，一个用于用来记录在显微镜（绿光，红光荧光和明视场图像）的图像的每个信道的堆叠。 “栈” – – 选择“图像”分开堆叠成单独的通道图像“堆栈图像”在ImageJ的控制面板。 注：图像出现，编号为1/3（绿色通道），2/3（红色通道）和3/3（明场）。这里，亮场图像被从分析中排除。 来分析图像，通过选择变换每个为8位的图像“图像” – “型” – “8位”。 “设置比例” -确定像素2的占用面积，使用“分析”重置图像的规模。当一个窗口，不同规模的选项弹出，选择“单击以清除水垢”复位规模。选中选项“全球”，以去除水垢对所有打开的图像。 要删除的背景下，利用画在ImageJ的控制面板上的“椭圆”工具荧光区域外的椭圆形区域（感兴趣区域，ROI）。 以确保该背景椭圆的大小是所有分析的图像是相同的，通过键盘的[T]字符它添加到的ROI经理。一个ROI管理器窗口出现在背景椭圆ROI可以通过“更多”保存 – “保存”选项。 如果背景椭圆的ROI是在图像上可见的，测量的区域的强度通过选择“分析” – “测量”。 注：结果其中，除其他的平均荧光强度显示在标有“平均”的列中显示的窗口。 “数学” – – “减”和插入测量值被取消选择背景椭圆ROI，单击“进程”中减去从图像的平均背景荧光强度值。 “调整” – – “阈值”选项通过“图像”应用​​到图像的阈值。选择方法大津和黑白（B＆W）。检查“黑暗背景”选项，并单击“应用”应用的门槛。 注：其中阈值以上的区域中的白色和被示于下面的黑色示出了阈值的图像改变为二进制图像。 通过选择“分析”一切超出阈值 – “分析粒子”的选项。在与设置的窗口，保持默认选项，并保持了“显示结果”和“Summarize“选项选中，单击”确定“，显示在结果窗口中的总结和展示在标柱被占领区”总面积“。