Поток Cytometric Анализ связанного с твердыми частицами Bet v 1 аллергена в PM10
Summary
Здесь мы приводим протокол для количественного определения аллерген нагруженных частиц с помощью проточной цитометрии. Окружающие частицы твердых частиц могут выступать в качестве носителей адсорбированных аллергенов. Покажем, что здесь проточной цитометрии, метод широко используется для характеристики взвешенных твердых частиц> 0,5 мкм в диаметре, можно использовать для измерения этих аллерген нагруженных частиц.
Abstract
Проточная цитометрия является метод широко используется для количественного определения взвешенных твердых частиц, таких как клетки или бактерии, в диапазоне размеров от 0,5 до нескольких десятков микрон в диаметре. В дополнение к характеристике вперед и вбок свойств рассеяния, она позволяет использовать флуоресцентные маркеры маркированы как антитела для обнаружения соответствующих структур. Использование косвенную с использованием меченых антител, проточной цитометрии используется здесь, чтобы определить количество пыльцы березы аллерген (точно Bet v 1) -loaded частиц от 0,5 до 10 мкм в диаметре в ингаляционном твердых частиц (PM10, размер частиц ≤10 мкм в диаметре). Частицы PM10 могут выступать в качестве носителей адсорбированных аллергенов, возможно, их транспортировки в нижних отделах дыхательных путей, где они могли бы вызвать аллергические реакции.
До сих пор содержание аллергена РМ10 было изучено с помощью твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) и сканирующей электронной микроскопии. ELISA меры, растворенного и не частицы-связанного аллергеном. По сравнению с сканирующей электронной микроскопии, который может визуализировать аллерген нагруженных частиц, проточной цитометрии, может дополнительно определить количество их. Как содержание аллергена окружающего воздуха может отклоняться от березовой пыльцы, аллергические симптомы могут, возможно, лучше коррелируют с воздействием аллергена, чем при подсчете пыльцы. В сочетании с клиническими данными, данный способ дает возможность проверить в будущих экспериментах ли аллергические реакции на пыльцу березы антигены связаны с содержанием Bet v 1 аллергеном частиц PM10> 0,5 мкм.
Introduction
Загрязнение воздуха в настоящее время рассматривается в качестве важной экологической причиной повышенной заболеваемости и тяжести дыхательной аллергии , наблюдаемых в последние десятилетия 1-3. Кроме того, существует растущий интерес к распределению общих аллергенов в пыли 4,5.
Березовая пыльца может вызвать сенную лихорадку , но также может быть важным фактором , аллергической астмы 6-8. Всего пыльцы березы, скорее всего, чтобы войти в нижние дыхательные пути, или можно найти в PM10 в результате его размера (22 мкм в диаметре) нет. Тем не менее, пыльцы березы аллергены , такие как Bet V 1, основной компонент пыльцы березы аллергеном, может быть освобожден после того, как пыльца разрыва 9 и может связываться с частицами 10 окружающего воздуха, таким образом , возможно , ввести нижние дыхательные пути. Действительно, было показано , что РМ10 могут содержать биологически активные аллергены , как продемонстрировано путем активации в пробирке базофилов из пыльцы аллергическим пробанда 11 </suр>.
Bet v Содержание 1 аллерген в образцах PM10 было изучено путем извлечения соответствующего аллергена и последующего количественного определения с ELISA 12-14. С помощью метода ELISA, растворенный аллерген измеряли, но количество аллергенных нагруженных частиц до сих пор оставалось неизвестным. Сканирующая электронная микроскопия выявили аллерген нагруженных частиц , но не позволяет количественно оценить 10,15.
Это исследование использует проточной цитометрии для количественной оценки доли Bet v 1-нагруженных частиц РМ10 в пробах атмосферного воздуха. Из-за предела обнаружения потока цитометр только частицы могут быть изучены больше, чем 0,5 мкм. > 0,5 мкм фракция PM10 будет далее как PM10> 0,5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важным шагом протокола является использование соответствующего фильтра для сбора частиц РМ10 из окружающего воздуха (см шаг 1.1). Фильтр должен быть достаточно прочным, чтобы выдержать чистки зубов с электрической зубной щеткой, а не все фильтрующие материалы отвечают этому требованию. Протокол окрашивания был установлен с концентрацией частиц PM10 8×10 6 частиц на мл. Однако, если материал ограничен и аккумулирование образцов не подходит, метод, вероятно, работать как хорошо, но антител концентрации (см шаги 3.5 и 3.8), возможно, должны быть скорректированы.
Bet v 1 окрашивание частиц PM10 не приводило к различным населения положительно и отрицательно окрашенных частиц. Это может быть вызвано различными количествами Bet v 1 аллергеном, адсорбированных на каждой из частиц в пределах от очень мало до большого количества. Это может привести к расширению сигнала APC таким образом, сдвигая населения кAPC позитивности. Поскольку трудно отделить положительные от отрицательных частиц, два метода количественного определения, были использованы для определения различий в содержании Bet v 1 РМ10> 0,5 образцы: (I) относительной количественной оценки путем измерения срединного APC интенсивности флуоресценции всех частиц и (II) определения процентного содержания APC положительных частиц. Что касается ставки v 1 груз частиц от низкого и высокого сезона пыльцы PM10> 0,5, оба метода показали аналогичные результаты. Тем не менее, относительное количественное определение по срединной интенсивности флуоресценции всех частиц рекомендуется, поскольку это не зависит от размещения ворот и, следовательно, возможно, менее подвержены ошибкам.
На сегодняшний день многие исследования изучить содержание аллергенов в воздух твердых частиц окружающей среды путем экстракции соответствующего аллергена и последующего количественного определения с ELISA 5,12-14,17. Существует принципиальная разница между процедурой, описанной здесь и quantificatioп с ELISA: ELISA квантифицирует извлеченный и растворенный антиген, а проточной цитометрии анализирует антиген связанного с твердыми частицами. С помощью ELISA бет V 1 нагрузки испытуемых образцов РМ10 (п = 8) была ниже предела обнаружения 1,2 нг / мл (данные не показаны). Точно так же, Buters и другие не определены специальные ставки V 1 в ПМ <2,5 мкм фракции и только около 7% в 10 мкм> PM> фракции 2,5 мкм, но более 93% в ПМ> 10 мкм фракции окружающего воздуха 13. Противоположные результаты ELISA с одной стороны, и анализа FACS, с другой стороны, может быть вызвана различиями в способе обнаружения в сочетании с расходящимися чувствительностью. Дальнейшие исследования, однако необходимо, чтобы полностью понять эту разницу.
Способ визуализации связанного с твердыми частицами антигена сканирующей электронной микроскопии 10,14. Методом сканирующей электронной микроскопии, Ormstad и др. Визуализированы Bet v 1 на поверхности взвешенных частиц штейнаЧастицы сажи г пробы в высокий сезон пыльцы и в меньшей степени от частиц , отобранных в низкий сезон пыльцы 15. Кроме того, были найдены аллергенами из пыльцы, латекса , а также бета-глюканы , чтобы адсорбировать на частицах сгорания в окружающем воздухе 10. Этот метод, однако, не позволяет количественно оценить частицы переплете аллергеном.
При использовании проточной цитометрии, связанного с твердыми частицами Bet v 1 аллергеном может быть определена количественно. Таким образом, проточная цитометрия может предложить новый способ охарактеризовать биологическую фракцию РМ10 от 10 до 0,5 мкм , как с другими подходящими антителами на руке, этот метод может быть распространен на обнаружение других антигенов на окружающих частиц воздуха, например, плесень, пылевой клещ аллергены или LPS. Поскольку частицы PM10 адсорбировать не только биологический материал, но и химические вещества и металлы довольно легко, неспецифическое связывание антител, однако, может создать проблему. Если новое антитело тестируют, очень важный шаг, чтобы доказать конкретную привязкуING. Это может быть сделано с помощью, например, блокирования связывания способности конкретного антитела с соответствующим антигеном , а затем окрашивать 11.
Как Bet V 1 Содержание окружающего воздуха может отличаться от березовой пыльцы 12,13,18, аллергические симптомы могут , возможно , лучше коррелируют с уровнем аллерген , чем пыльца рассчитывать 14,18. Таким образом, данный способ в сочетании с клиническими данными позволяет исследовать в будущих экспериментах ли аллергические реакции на березу соответствуют Bet v 1 аллергеном нагрузки PM10> 0,5.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Katrin Bossmann, Anett Neumann and Eike Wolter (German Environment Agency) for their valuable preparatory work.
Materials
| Teflon filter | Pall Life Sciences, USA | R2PL047 | 47 mm, 1.0 µm |
| low volume sampler | Sven Leckel Ingenieur Büro GmbH, Germany | LVS3 | air flow of 2.3 m3/h |
| Phosphate-buffered saline | Biochrom, Germany | L1825 | without Ca/Mg, low endotoxin |
| electrical toothbrush | Braun, Germany | Oral-B Vitality Sensitive | |
| Casy cell counter | Schärfe System GmbH, Germany | Model TTC | range of detectable particle size: 0.7 µm to 45 µm |
| FACSCanto II | Becton Dickinson, USA | 3-laser, 8-color (4-2-2) | |
| FACS Diva Software v6.1.3 | Becton Dickinson | ||
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | |
| monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1 | Indoor Biotechnologies, UK | MA-3B4 | clone MA-3B4 |
| APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody | Becton Dickinson | 560089 | clone A85-1 |
| SPSSTM software version 18 | PASW Statistics 18, Hongkong, China | ||
| Petri Dish | Gosselin, France | BP50-02 | D 55mm, H 15mm |
| FACS Tube | Becton Dickinson, USA | REF 352054 | 5ml Polystyrene |
| CASYton | Roche Germany |
REF 05651808001 | |
| Matrix Blank Tubes | Thermo Scientific, USA | 4140 | 1,4 ml, PP |
| Centrifuge | Heraeus, Thermo Scientific | Megafuge 40R | |
| Vacuum Pump | INTEGRA Biosciences AG, Switzerland | Model 158 320 | Inetrgra Vacusafe |
| recombinant Bet v 1a antigen | Indoor Biotechnologies, UK | LTR-BV1A-1 | Concentration: 2.0 mg/ml |
References
- Cakmak, S., Dales, R. E., Coates, F. Does air pollution increase the effect of aeroallergens on hospitalization for asthma?. J Allergy Clin Immunol. 129 (1), 228-231 (2012).
- Barraza-Villarreal, A., et al. Air pollution, airway inflammation, and lung function in a cohort study of Mexico City schoolchildren. Environ Health Perspect. 116 (6), 832-838 (2008).
- Chen, B. Y., et al. The association of ambient air pollution with airway inflammation in schoolchildren. Am J Epidemiol. 175 (8), 764-774 (2012).
- Cyprowski, M., Buczynska, A., Szadkowska-Stanczyk, I. Indoor allergens in settled dust from kindergartens in city of Lodz, Poland. Int J Occup Med Environ Health. 26 (6), 890-899 (2013).
- Brough, H. A., et al. Distribution of peanut protein in the home environment. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 623-629 (2013).
- Galli, S. J., Tsai, M., Piliponsky, A. M. The development of allergic inflammation. Nature. 454 (7203), 445-454 (2008).
- World Health Organisation, R. O. f. E. Phenology and human health: allergic disorders: report on WHO meeting Rome, Italy. , 256 (2003).
- Wuthrich, B., Schindler, C., Leuenberger, P., Ackermann-Liebrich, U. Prevalence of atopy and pollinosis in the adult population of Switzerland (SAPALDIA study). Swiss Study on Air Pollution and Lung Diseases in Adults. Int Arch Allergy Immunol. 106 (2), 149-156 (1995).
- Grote, M., Valenta, R., Reichelt, R. Abortive pollen germination: a mechanism of allergen release in birch, alder, and hazel revealed by immunogold electron microscopy. J Allergy Clin Immunol. 111 (5), 1017-1023 (2003).
- Namork, E., Johansen, B. V., Lovik, M. Detection of allergens adsorbed to ambient air particles collected in four European cities. Toxicol Lett. 165 (1), 71-78 (2006).
- Süring, K., et al. PM10 contains particle-bound allergens: Dust analysis by Flow Cytometry. Env Technol Inn. 5, 60-66 (2016).
- Schappi, G. F., Suphioglu, C., Taylor, P. E., Knox, R. B. Concentrations of the major birch tree allergen Bet v 1 in pollen and respirable fine particles in the atmosphere. J Allergy Clin Immunol. 100 (5), 656-661 (1997).
- Buters, J. T., et al. The allergen Bet v 1 in fractions of ambient air deviates from birch pollen counts. Allergy. 65 (7), 850-858 (2010).
- Buters, J. T. M., et al. Release of Bet v 1 from birch pollen from 5 European countries. Results from the HIALINE study. Atmos Environ. 55, 496-505 (2012).
- Ormstad, H., Johansen, B. V., Gaarder, P. I. Airborne house dust particles and diesel exhaust particles as allergen carriers. Clin Exp Allergy. 28 (6), 702-708 (1998).
- Brough, H. A., et al. Peanut protein in household dust is related to household peanut consumption and is biologically active. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 630-638 (2013).
- Jochner, S., et al. Seasonal variation of birch and grass pollen loads and allergen release at two sites in the German Alps. Atmos Env. , (2015).
