Flusso analisi di citometria di Particle-bound Bet v 1 allergene in PM10

NOTA: Questo protocollo descrive la colorazione indiretta di particelle PM10 con un anticorpo monoclonale (mouse anticorpo monoclonale IgG1, clone MA-3B4) contro Bet v 1, il principale componente polline di betulla antigene, più un Allophycocyanin (APC) -labeled anticorpo secondario (anti anticorpo -mouse IgG1, clone A85-1) e la successiva analisi su un citofluorimetro. Con opportune altri anticorpi disponibili, questo metodo potrebbe essere esteso al rilevamento di altri antigeni legati alle particelle nell'aria ambiente. 1. PM10 campionamento Raccogliere PM10 dal nell'aria ambiente politetrafluoroetilene (PTFE) filtri utilizzando un campionatore basso volume con una portata di 2,3 m 3 / hr (Figura 1). Una caratterizzazione del campionatore utilizzato per gli esperimenti descritti qui si trova in 16. Tempo di esecuzione dipende dalla quantità di PM10 necessario (solitamente tra 1 e 10 giorni). Al termine del periodo di incubazione, rimuovere il filtro dal campionatore e congelare a-20 ° C fino al momento dell'uso. Figura 1. Basso volume PM10 campionatore. Esempio di un basso volume di campionatore PM10. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Rimozione 2. PM10 e conte di particelle Lasciate che il disgelo filtro in PTFE per circa 5 minuti. Poi, mettere il filtro in polistirolo pulito Petri (Figura 2A). Prendere un nuovo piatto Petri per ogni filtro, se più di un filtro viene elaborato. Successivamente, sovrapporre il filtro PTFE con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Questo protocollo è stabilito per una concentrazione di PM10 finale della 8×10 6 particelle per ml (vedi punto 3.3). Per ottenere almeno quella concentrazione, utilizzare il seguente volume di empirica di PBS di sovrapporre il filtro con: Se il tempo di raccolta PM10 era < 2 giorni, utilizzano 2 ml. Per tempi di incubazione ≥ 2 giorni, utilizzare 4 ml. NOTA: Al fine di aumentare la concentrazione di particelle della sospensione PM10, sospensioni di diversi filtri possono essere raggruppati, se questo è appropriato. Tenere il filtro in PTFE con una pinzetta e pennello con uno spazzolino da denti elettrico con una testa sensibile pennello per 1 min (figure 2B, 2C). Trasferire la particella-PBS-sospensione, sospensione PM10 seguito definito, ad un tubo di reazione pulito. Figura 2. rimozione PM10 con uno spazzolino elettrico. Un filtro di politetrafluoroetilene con campionamento PM10 viene posto in un polistirolo Petri (A) ed è rivestito con 4 ml di PBS. Poi, PM10 viene rimosso con uno spazzolino elettrico (B: prima di spazzolatura e C: dopo la spazzolatura per 1 min).= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Misurare la concentrazione di particelle PM10, ad esempio, mediante l'uso di un contatore di particelle. Diluire un volume adeguato di PM10 sospensione ad esempio 50 microlitri in 10 ml tampone di misura isotonico, misurare tre volte e calcolare il numero totale medio di particelle per ml. Assicurarsi di utilizzare un contatore di particelle in grado di rilevare le particelle di dimensioni rilevanti. 3. Bet v 1 colorazione Calcolare il numero di provette di reazione richiesti per l'analisi del campione: Almeno tre sono necessari tubi di reazione: (i) un tubo con un solo campione (controllo nativo) (ii) un tubo con il campione più anticorpo secondario (controllo negativo), e ( iii) un tubo con il campione più anticorpo primario e secondario (campione specifico). Se misurato per la prima volta, preparare almeno due provette per (i) (ii),e (iii) di avere abbastanza materiale per regolare correttamente le impostazioni citofluorimetro (vedi punto 4.1). Calcolare la quantità di sospensione PM10 richiesto per il numero di provette di reazione. Ogni tubo reazione richiede 50 ml di sospensione. Regolare la concentrazione di particelle misurata nel passo 2.4 per il volume della sospensione calcolata al punto 3.2 ad una concentrazione finale di 8×10 6 particelle per ml aggiungendo una quantità appropriata di PBS. NOTA: La sospensione PM10 rimanente può essere congelato a -20 ° C per gli esperimenti futuri, anche se per questo protocollo appena Si raccomanda la sospensione PM10 preparati. Block legame aspecifico completando la sospensione PM10 con albumina di siero bovino (BSA) ad una concentrazione finale di 0,02%, utilizzando una soluzione madre, ad esempio 1% BSA preparato con PBS. Vortex brevemente e incubare per 20 min a temperatura ambiente. Per ogni campione da analizzare mediante citometria di flusso, trasferire 50 ml di sospensione dal punto 3.4 a corrente alternatatubo di reazione magra. Aggiungere un anticorpo monoclonale di topo contro Bet v 1 ad una concentrazione finale di 0,02 mg / mL per le provette di reazione designati per la colorazione specifica, vortex brevemente e incubare per 60 min a temperatura ambiente. Lasciare le provette di reazione con la sospensione PM10-BSA designato per il controllo nativo e il controllo negativo anche stare per 60 min a temperatura ambiente. Lavare tutti i campioni con l'aggiunta di 500 microlitri di PBS integrato con 0,02% BSA per ciascun tubo di reazione, brevemente vortex e centrifugare i campioni successivamente a 4.700 xg per 5 min a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante con cura utilizzando una pompa a vuoto. Ripetere il punto 3.6. Determinare la quantità totale di anticorpo anti-IgG1 di topo secondario APC-etichettato necessario: 1 mg anticorpi sciolto in 50 ml di PBS integrato con 0,02% di BSA per tubo di reazione. Diluire la quantità appropriata di anticorpi con il rispettivo volume di PBS integrato con 0,02% BSA. Aggiungere 50 ml di anticorpo secondario diluito a tutte le provette di reazione ad eccezione del tubo di reazione designato per il controllo nativo. Supplemento quest'ultima con 50 ml di PBS integrato con 0,02% di BSA. Vortex tutti i campioni per alcuni secondi. Incubare tutti i campioni per 30 minuti al buio. Ripetere il punto 3.6 due volte. Aggiungere 50 ml di PBS per ogni reazione tubo, vortice e analizzare i campioni su un citofluorimetro. 4. analisi di citometria di flusso Utilizzando il controllo nativo, regolare le seguenti citometro parametri per ottimizzare l'analisi dei dati. Utilizzando il controller soglia di forward scatter (FSC) visualizzato sulla scheda di controllo del dispositivo, impostare la soglia FSC al valore più basso (200) e avviare l'analisi. Usando il regolatore di tensione a dispersione, regolare l'FSC e dispersione laterale (SSC) in questo modo che tutte le particelle PM10 possono essere rilevati e che la popolazione di particelle si trova a circa in the centro dell'asse FSC e nella metà inferiore dell'asse SSC. Utilizzando il regolatore di tensione di fluorescenza, regolare la tensione APC e un'altra tensione di fluorescenza come isotiocianato di fluoresceina (FITC), che non emette alla stessa lunghezza d'onda come APC, se necessario. Assicurarsi che tutte le particelle sono visibili nella metà inferiore di entrambi gli assi di fluorescenza. Consecutivamente, esaminare ogni campione compreso il controllo nativo e memorizzare i dati FSC, SSC, APC, e FITC di almeno 10.000 particelle per campione. Valutare i dati con il relativo software. contenuto allergenico adsorbito nel campione specifico può essere quantificato in due modi: Analizzare l'intensità di fluorescenza APC di tutte le particelle (valore mediano) come misura di Bet v 1 carico su tutte le particelle PM10. NOTA: Se il campione specifico conteneva allergene, intensità di fluorescenza APC dovrebbe aumentare nel campione specifico rispetto al controllo negativo. Al contrario, altre fluorintensità escence (ad es., FITC intensità di fluorescenza) non devono cambiare in modo significativo. Calcolare la percentuale di particelle PM10 con limite anti-Bet v 1 anticorpi. In tal modo, nel controllo negativo, impostare un cancello intorno particelle considerate APC positivo, copia e incolla questo cancello nel campione specifico e sottrarre la percentuale di APC particelle positive nel controllo negativo dalla percentuale di APC particelle positive nel campione specifico.