Trasduzione retrovirale di cellule T helper come un approccio genetico per studiare meccanismi che controllano la loro differenziazione e funzione

Tutto il lavoro del mouse eseguiti in questi protocolli è stata effettuata in base alle procedure animali scientifici Act, Regno Unito sotto l'animale Progetto licenza 70/6965. 1. retrovirale Produzione Prima di procedere ottenere tutte le autorizzazioni necessarie per la produzione di organismi geneticamente modificati e l'uso di retrovirus in cellule di mammifero. Crescita delle cellule HEK 293T Crescere le cellule 293T HEK il 10 cm piatti di coltura tessutale media HEK 293T (Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) con siero 10% fetale bovino (FBS), 100 unità / ml penicillina 0,1 mg / ml di streptomicina, e 2 mm L-glutammina) . Per il passaggio delle cellule in generale, le celle divise 1:10 quando raggiungono confluenza rimuovendo medio e pipettando le cellule dal piatto con il mezzo HEK 293T fresco. NOTA: Le cellule devono raggiungere confluenza in 2-3 giorni. cellule 293T HEK attribuiscono liberamente alla piastra in modo tripsinizzazione non è necessaria. 24 ore prima della trasfezione, dividere una confluent piatto di cellule 1:10 ad una piastra 10 cm (In una piastra per trasfezione) in modo che il giorno successivo le cellule sono ~ 50% confluenti. Transfection da fosfato di calcio Precipitazioni Circa 1 ora prima della trasfezione, rimuovere medie da cellule e accuratamente aggiungere 9 ml di terreno HEK 293T fresca per impedire alle cellule staccano dalla piastra. Preparare 2x Hepes Buffered Saline (2x HBS) e un nuovo 2,5 M CaCl 2 soluzione come descritto nella Tabella 1. Scongelare scorte DNA. Per le trasfezioni utilizzazione più efficace DNA plasmidico qualità prep. In un 6 ml fondo rotondo o tubo da 15 ml aggiungere 5 mg di retrovirale DNA (pMIG) 4, 5 mg di DNA virus helper (PCL-Eco) 7, e H 2 O a 420 ml. Aggiungere 80 ml di 2,5 M CaCl 2 portando il volume finale a 500 microlitri. Nota: Questo insieme con il passo successivo (aggiunta di 2x HBS) può essere fatto su una panchina regolare finché ster generaletecnica ile viene utilizzato. Aggiungere lentamente 500 ml di 2x HBS goccia a goccia alla miscela DNA sopra mentre delicatamente vortex in modo che la soluzione è continuamente misto e Capo 4 precipita in cristalli pari dimensioni. Trasferire ad una cappa coltura tissutale e aggiungere lentamente la miscela DNA Capó 4 (1 ml) goccia a goccia i 9 ml di terreno che coprono le cellule mentre costantemente e dolcemente vorticoso piastra. Ancora una volta, fare attenzione a non staccare le cellule dalla piastra. Mettere le cellule di nuovo nel incubatore. NOTA: A questo punto il precipitato Capó 4 sarà facilmente visibile sotto un microscopio come piccoli cristalli delle dimensioni di batteri. Questi sono facilmente osservati dopo 30-60 minuti, quando i cristalli hanno avuto la possibilità di depositarsi sul fondo del piatto. Raccolta dei virus in sovranatanti. Il giorno seguente (ovunque 12-24 ore dopo la trasfezione) rimuovere il supporto e nutrire le cellule con 10 mldi media HEK 293T fresco, ancora una volta facendo attenzione a non staccare le cellule dalla piastra. NOTA: Questo diluisce le sostanze inibenti linfociti che le cellule HEK 293T secernono nel mezzo durante la trasfezione. La sera del secondo giorno (~ 24 ore dopo la trasfezione) nutrire le cellule con 3,5 ml di terreno HEK 293T fresco. Fare attenzione che la piastra è posta esattamente a livello in incubatrice modo che un lato non è lasciata a secco. Raccogliere media ~ 12 ore dopo (conservare a 4 ° C) e dei mangimi con 3,5 ml di terreno HEK 293T fresco. Ripetere collezione altre 2 volte a circa 12 intervalli hr in modo che circa 10 ml di mezzo viene raccolto. Questo è lo stock di virus. Spin eventuali cellule HEK 293T residui e detriti cellulari mediante centrifugazione a 600 xg per 5 min. In alternativa, filtrare con un 0,45 micron, basso legame proteico, filtro siringa. Conservare virus a 4 ° C, e per i migliori titoli, usa entro un giorno o due, come il titolo lentamente diminuirà a 4 ° C. Non frEeze, in quanto ciò riduce significativamente il titolo. 2. Isolamento di cellule T CD4 primaria Naïve Isolamento di cellule leucociti Euthanize topi di dislocazione cervicale, CO 2 asfissia, o altro protocollo umanitario adeguato alle regole di gestione degli animali dell'istituzione. Sezionare topi appena eutanasia e rimuovere milza e linfonodi desiderato nodi 15. Posizionare gli organi in pozzetti di una piastra di coltura tissutale 6 pozzetti contenenti mezzo R10 (RPMI con 10% inattivato al calore FBS, 100 unità / ml penicillina, 0,1 mg / ml streptomicina, 2 mM L-glutammina, e 0,1% β-mercaptoetanolo) . Utilizzare una cappa di coltura cellulare per la dissezione di topi e tutte le manipolazioni successive per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione di culture. NOTA: Mantenere la media R10 freddo ed eseguire tutte le fasi di purificazione a valle a 4 ° C. Posizionare un 70 micron coltura cellulare colino in un 50 ml tubo conico contenente circa 5 ml di terreno R10. Utilizzare uno colino per la milza e linfonodi fino a tre topi. Aggiungere milza e nei linfonodi al setaccio cellulare e macerazione con l'estremità di una siringa stantuffo 5 ml. Risciacquare con 1-2 ml di terreno R10. Trasferire le cellule in un tubo da 15 ml e portare il volume a 14 ml con R10. Centrifugare a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C. Gettare il surnatante versando fuori con un movimento pulito per evitare di disturbare il pellet. Aggiungere 2 ml di freddo (4 ° C) di tampone di lisi eritrocitaria (Tabella 1) a ciascuna provetta. Mescolare delicatamente per 3,5 min, mantenendo la provetta in ghiaccio. NOTA: I tempi di lisi dei globuli rossi è fondamentale per prevenire la morte dei linfociti. Pertanto, il tempo esatto di ogni lotto di tampone di lisi cellulare Red dovrà essere ottimizzata. Aggiungere ≈12-13 ml di terreno R10. Immediatamente centrifuga e scartare il surnatante come al punto 2.1.5. Eseguire la procedura di lavaggio 2x più spiritomedio h R10 per rimuovere qualsiasi tampone di lisi eritrocitaria residuo dalle cellule ed evitare la morte dei linfociti. Contare le cellule in un emocitometro diluendo 1:20 trypan blu per determinare la resa di cellule vitali. Aspettatevi circa 8-10 x 10 7 cellule per il mouse. Isolamento di cellule T CD4 + Uso Magnetic Beads Kit per rimuovere CD8 +, CD11b +, CD16 / 32 +, CD45R +, MHC di classe II + e Ter-119 + Cells. Aliquota 8-10 x 10 7 cellule dal punto 2.1.8 per tubo da 15 ml e centrifugare a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante con un unico movimento pulito per evitare di disturbare il pellet. Risospendere le cellule in ogni tubo in 100 ml di FBS inattivato al calore, quindi aggiungere 100 ml di miscela di anticorpi dal kit. Incubare per 30 minuti a 4 ° C con miscelazione delicata su un rullo. Mentre le cellule di cui sopra sono incubazione preparare le perline. Perline risospendere in flacone vortexando per> 30 sec poi trasferire 1 ml di perle per 8-10 x 10 7 cellule preparate ad un tubo da 15 ml. Aggiungere 2 ml di terreno R10 per ml di perline e mescolare delicatamente. Posizionare il tubo nel magnete per 1 min poi scartare il surnatante. Rimuovere il tubo dalle perline magnete e risospendere in 4 ml di terreno R10. Questa quantità di perline è sufficiente per due turni di incubazione. Lavare le cellule alla fine dell'anticorpo incubazione (Passo 2.2.1) aggiungendo 10 ml di R10 mezzo per provetta. Delicatamente mescolare bene con vorticoso delle tubolare e centrifugare a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante con un unico movimento pulito per evitare di disturbare il pellet. Risospendere le cellule in 1 ml di terreno R10. Aggiungere 2 ml di perline lavati dal punto 2.2.2.2 (½ dell'importo preparato per ciascun tubo) a ciascuna provetta di cellule anticorpi trattata e incubare per 30 minuti a 4 ° C con miscelazione delicata su un roller. Risospendere la miscela di cellule-bead pipettando delicatamente 5 volte con una pipetta contenente una stretta apertura punta. Evitare la formazione di schiuma. Porre il tubo nel magnete perline per 2 minuti poi trasferire il surnatante contenente le cellule selezionate negativamente in una nuova provetta. Conservare queste cellule, in quanto sono la popolazione CD4 +. Ripetere selezione negativa ancora una volta. Spin le cellule dal punto 2.2.5 a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante come al punto 2.2.3 e risospendere in 1 ml di terreno R10. Seguire i punti 2.2.4 e 2.2.5 di nuovo. Dopo la selezione finale tallone magnetico, contare le cellule per determinare il recupero (rendimenti tipici sono 15-20 x 10 6 cellule per 10 8 leucociti). Isolamento di cellule naive T CD4 + CD25 (- e CD62L alta) utilizzando le colonne di separazione cellulare Centrifuga CD4 + T cellule a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere in 150-200 ml diMedio R10 per 10 8 cellule. Aggiungere 2 ml di brodo biotinilato anticorpo monoclonale CD25 (clone 7D4). Incubare per 30 minuti a 4 ° C con miscelazione delicata su un rullo. Lavare le cellule aggiungendo 10 ml di tampone colonna di separazione cellulare (Tabella 1). Centrifugare a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il più surnatante possibile e stimare il volume di tampone / cellule rimanenti. Risospendere ad un volume finale di circa 90 microlitri per 10 7 cellule. Aggiungere 20 ml di streptavidina perle per 10 7 cellule e mescolare con colpi di frusta dolci. Incubare per 15 minuti a 4 ° C. Mentre le cellule sono incubazione preparare le colonne di separazione cellulare medio (MS) per l'approccio manuale. Ogni colonna MS mantiene 10 7 cellule, e dal momento che le cellule CD25 + in genere rappresentano circa il 10% del totale cellule CD4 +, utilizzare 1 colonna per 10 8 cellule T CD4 +. Aggiungere 500 microlitri di tampone colonna di separazione cellulare alla colonnae lasciare che il flusso attraverso. Ripetere altre 2 volte. Al termine dell'incubazione delle cellule / branello, lavare le cellule aggiungendo 10 ml di tampone colonna di separazione cellulare e centrifugazione a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere le cellule in 500 ml di separazione delle cellule buffer di colonna per 10 8 cellule, ma ancora usare 500 microlitri se ci sono meno cellule. Applicare 500 microlitri di sospensione cellulare / tallone alla colonna e raccogliere il flusso attraverso. Passare questo sopra la colonna 1 più tempo e raccogliere il flusso attraverso nuovamente. Lavare la colonna 3 volte con 500 ml di buffer di colonna di separazione cellulare, aggiungendo ogni flusso attraverso di questi risciacqui alle cellule raccolte. Questi sono il CD25 – cellule. Contare le celle per determinare la resa. Se Tregs (CD25 + cellule) sono desiderati, isolare come segue. Rimuovere la colonna dal separatore e tenerlo sopra un tubo universale presa cura aperta per mantenere la sterilità. pipetta rapidamente 500 ml di buffer di separazione delle cellule sul colleumn e saldamente risciacquare la frazione positiva, utilizzando lo stantuffo fornita con la colonna. Ripetere la procedura di lavaggio altre 2 volte. Passare il frazione positiva su una colonna di separazione cellulare fresca MS e scartare questo flusso passante. Saldamente scovare le cellule positive per tre volte, come prima e centrifugare le cellule a 600 xg per 5 min a 4 ° C. Risospendere le cellule in 1 ml di terreno R10 e contare per determinare la resa. Per ottenere CD25 – cellule di alta T CD62L, centrifugare la CD25 – cellule T isolate sopra al punto 2.3.6 a 600 xg per 5 minuti a 4 ° e risospendere in 150-200 ml di R10 media per 10 7 cellule. Aggiungere 5 ml di brodo biotinilato anticorpo monoclonale CD62L (clone MEL-14) e incubare per 30 minuti a 4 ° C con miscelazione delicata su un rullo come prima. Eseguire lavaggio, streptavidina tallone vincolante, e la preparazione colonna di separazione delle cellule Treg come descritto per il protocollo di isolamento (2.3.7). Questa volta l'usocolonna grande separazione cellulare (LS), che ha una capacità di 10 8 cellule. Dato che le cellule T ad alta CD62L in genere rappresentano circa il 60-70% di CD25 – cellule, utilizzare 1 LS colonna di separazione cellulare per 10 a 8 celle. Aggiungete il composto di cellule / tallone colonna di separazione delle cellule LS come descritto al punto 2.3.6 – questa volta scartando il flusso finale attraverso e colonna risciacqua. Raccogliere le cellule di alta T CD62L come descritto al punto 2.3.7 per la raccolta di cellule CD25 +. cellule centrifugare a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere le cellule in 1 ml di R10 e contano per determinare la resa. Diluire a 0,75-1 X10 6 cellule per ml in media R10. Analizzare purezza di celle di classificare cellulare fluorescente-attivata (FACS). strategia di colorazione FACS Per le cellule pre e post tutte le fasi di isolamento, macchia con CD4-FITC, CD8a-PerCP-Cy5.5 (cellule helper e T citotossici), e MHCII-PE (MHC di classe II cellule che esprimono). Per le cellule pre e post isolamento CD25, macchia con CD4-FITC e CD25-PE (Treg rispetto ad altre cellule T helper). Per le cellule pre e post CD62L isolamento macchia con CD4-FITC, CD62L-PE e CD44-APC (naive rispetto a celle di memoria e effettrici T helper). Per ogni luogo di analisi 10 5 cellule in un pozzetto di una piastra ben U-bottom 96. Centrifugare a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il medio e lavare le cellule una volta con 200 microlitri DPBS. Centrifuga come sopra e versare fuori DPBS. Aggiungere 50 ml di DPBS per pozzetto e 0,5 microlitri di ciascun anticorpo (come indicato in 2.4.1) ed incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio per evitare lo sbiancamento marcatore fluorescente. Lavare le cellule 2x con DPBS come in 2.4.2 e immediatamente analizzare su un citofluorimetro utilizzando protocolli e linee guida specifiche per lo strumento a portata di mano. NOTA: Dopo la fase di isolamento finale di una buona preparazione, il 90-95% delle cellule saràessere CD4 + CD25 – cellule di alta T CD62L. 3. Trasduzione retrovirale di attivati cellule T CD4 + e la loro differenziazione in specifici sottoinsiemi T helper trasduzione retrovirale NOTA: l'integrazione retrovirale e l'espressione dei geni richiede la divisione cellulare. Pertanto, le cellule T devono essere attivati ​​O / N. Mentre isolare le cellule T naive, cappotto una piastra di coltura tissutale 24 bene con anti-CD3 e anti-CD28 diluiti in DPBS. Aggiungere 250 microlitri per pozzetto. Utilizzare Anti anti-CD3 a 1 ug / ml. Utilizzare anti-CD28 a 2 mg / ml se le cellule in ultima analisi, essere differenziati in Th0, Th1, Th2 e iTregs condizioni. Utilizzare anti-CD28 a 10 mcg / ml per le condizioni TH9 e Th17. Incubare ~ 2 ore a 37 ° C in un incubatore di coltura tissutale. Appena prima di coltura delle cellule, rimuovere la soluzione di anticorpi e lavare la piastra con ~ 250 ml di DPBS per pozzetto per rimuovere unbouanticorpo ND. Fare attenzione a non lasciare che la piastra di asciugare in modo da elaborare un massimo di 6 pozzi alla volta. Rimuovere DPBS lavare e aggiungere 1 ml di cellule naïve T CD4 + in terreno R10 a 0.75-1 x 10 6 cellule per ml. Attivare le cellule O / N (14-16 ore). Il giorno seguente, centrifugare le cellule nella piastra a 900 xg per 5 min a 30 ° C per fissare le cellule al fondo dei pozzetti. Raccogliere e salvare il medium facendo attenzione a non spostare le cellule, e sostituirlo con il surnatante 1 ml di cultura virus preparata dal protocollo di produzione del virus. Non lasciate che le pile a secco in modo elaborare un massimo di 4 pozzi per volta. Per ogni pozzetto aggiungere 1 ml di 8 mg / ml polibrene e 10 ml di 1M HEPES pH 7,5 per aiutare l'assorbimento di virus e prevenire significativo alcalinizzazione in CO 2 ambiente durante la successiva centrifugazione. Centrifugare le cellule a piastra a 900 g per 90 min a 30 ° C. Differenziazione delle cellule in SpeciFIC sottoinsiemi rimuovere con attenzione la cultura surnatante virus e sostituirlo con 1 ml del mezzo raccolti sopra al punto 3.1.4, in quanto contiene IL-2 e di altri fattori di crescita delle cellule T. Aggiungere i reagenti indicati nella tabella 2 e cultura cellule per 3-4 giorni di tempo per differenziare le cellule in sottoinsiemi specifici. L'analisi delle cellule Per la colorazione intracellulare di citochine, il trattamento di cellule con 1 mg / ml ciascuna di Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e ionomicina per 4 ore. Durante l'ultimo 2 ore di stimolazione, aggiungere 1 mg / ml di brefeldina A. Risospendere le cellule dal fondo di ciascun pozzetto pipettando su e giù parecchie volte. Trasferire circa 10 5 cellule ad una piastra da 96 pozzetti U basso (di solito 100 ml dal 1 ml di coltura di cellule Th) per la fissazione e la colorazione. Per GFP colorazione, fissare le cellule con 100 ml di 2% paraformaldeide a temperatura ambiente per esattamente 5 minuti, come un tempo di incubazione più lungo sarà sbiancare la GFP unND interferire con Foxp3 colorazione. Lavare le cellule aggiungendo 100 ml di DPBS ad ogni pozzetto e centrifugare a 600 xga 22 ° C per 5 min. Eliminare il surnatante. Attenzione: Paraformaldeide è tossico. Maneggiare in una cappa aspirante con la pelle e protezione per gli occhi. Fissare le cellule di nuovo con 100 microlitri di buffer 1x Fissazione fatta dal kit di colorazione Foxp3 (1 volume di fissaggio buffer da 3 volumi di diluente). Incubare le cellule per 45 minuti a temperatura ambiente o in alternativa incubare a 4 ° C per 16 ore. Dopo la fissazione, permeabilize cellule aggiungendo 100 ml di buffer di permeabilizzazione dallo stesso kit. Incubare a temperatura ambiente per 30-45 minuti poi centrifugare a 600 xga 22 ° C per 5 min. Per colorazione degli anticorpi, rimuovere la fissazione di buffer / permeabilizzazione e aggiungere 50 ml di tampone permeabilizzazione fresco. Aggiungere l'anticorpo richiesto diluito in tampone permeabilizzazione a 0,5 ml per 50 microlitri tampone per campione. Incubare per 30-45 minuti a temperatura ambiente al buio per evitare lo sbiancamento di influenzaEtichetta orescent. Aggiungere tampone permeabilizzazione 150 microlitri e centrifugare a 600 xga 22 ° C per 5 min. Eliminare il buffer di permeabilizzazione e aggiungere 200 microlitri DPBS. Analizzare su un citofluorimetro utilizzando protocolli e linee guida specifiche per lo strumento a portata di mano. NOTA: Assicurarsi di includere controlli adeguati per la citochina colorazione, come la colorazione con anticorpi di controllo isotipo, analizzando le cellule non attivate o Th0 attivati, etc.