Generieren<em> De Novo</em> Antigen-spezifische Zellrezeptoren humanen T von Retrovirale Transduktion von Centric Hemichain
Summary
Wir beschreiben hier ein neues Verfahren antigen-spezifische T-Zell-Rezeptoren (TCRs) durch Paarung der TCR & agr; oder TCR & bgr; TCR eines bestehenden, besitzen die Antigen-Spezifität von Interesse, mit komplementären hemichain der peripheren T-Zell-Rezeptor-Repertoire zu erzeugen. Die de novo erzeugt TZR behalten Antigen-Spezifität mit Affinität zu variieren.
Abstract
T-Zell-Rezeptoren (TCR) verwendet klinisch die Spezifität von T-Zellen zu lenken Tumoren als eine viel versprechende Modalität der Immuntherapie zu zielen. Daher ist die Klonierung TCRs spezifisch für verschiedene Tumor-assoziierte Antigene war das Ziel vieler Studien. eine wirksame T-Zell-Antwort hervorzurufen, muss das TCR das Zielantigen mit optimaler Affinität erkennen. Es wurde jedoch Klonierung solche TCRs eine Herausforderung und viele verfügbare TCRs besitzen suboptimalen Affinität für das zugehöriges Antigen. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zum Klonieren von de novo hoher Affinität antigen-spezifischen TCRs vorhandene TCRs durch hemichain centricity ausnutzt. Es ist bekannt, dass für einige TCRs jedes TCR & agr; oder TCR & bgr; hemichain nicht in gleicher Weise für die Antigenerkennung beitragen, und die dominante hemichain als zentrische hemichain bezeichnet. Wir haben, dass von der ursprünglichen Gegenkette unterscheiden durch Paarung der centric hemichain mit Gegen Ketten gezeigt, wir sind in der Lage, das Antigen s zu haltenpecificity, während die Wechselwirkungsstärke für das zugehöriges Antigen zu modulieren. Somit kann das therapeutische Potential einer gegebenen TCR durch Optimierung der Kopplung zwischen den zentrisch und Zähler hemichains verbessert werden.
Introduction
T-Zell-Rezeptoren (TCRs) sind heterodimere adaptive Immunrezeptoren von T-Lymphozyten exprimiert wird, die aus einer TCR & agr; und TCR & bgr; Kette. Sie werden über somatische Umordnung von V (D) J-Gensegmenten erzeugt, die praktisch unbegrenzte Konfigurationen von HLA / Peptid-Komplexe eine sehr vielfältige Repertoires der Lage zu erkennen, erzeugt. Klinisch entwickelt T – Zellen klonotypischen TCRs spezifisch für tumorassoziierte Antigene zu exprimieren zeigten Wirksamkeit bei einer Vielzahl von Krebsarten 1. Allerdings fehlt für das Antigen von Interesse ausreichende Affinität viele TZR für diesen Zweck geklont, die ihre therapeutische Anwendung begrenzen.
Hier beschreiben wir eine Methode, um diese Einschränkung für bestehende TZR zu überwinden, indem Kette Zentriert nutzen. Es wurde berichtet, dass ein TCR hemichain 2 eine dominantere Rolle bei der Erkennung des Zielantigens spielen könnte, hier genannt centricity. Kristallstrukturanalysen haben gezeigt, dass eine zentrierte gezeigthemichain eines TCR könnte für die Mehrheit des Fußabdrucks Konto auf dem MHC / Peptid – Komplex 3,4. Mit diesem Konzept haben wir bereits gezeigt , dass die SIG35α TCR & agr; mit einem vielfältigen Repertoire von TCR & bgr; Ketten paaren und zu pflegen Reaktivität gegen das MART1 27-35 Peptid präsentiert von HLA-A2 5. Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem TAK1 TCR erhalten, wobei die zentrische TCR & bgr; hemichain mit verschiedenen TCR & agr; Ketten gekoppelt und gehalten Reaktivität für das WT1 235-243 Peptid durch HLA-A24 präsentiert 6. Sowohl MART1 und WT1 sind tumorassoziierte Antigene. Kettenzentriertheit wurde auch 7 durch Paarung die invariante Vα24-Jα18 (Vα24i) TCR & agr; Kette von menschlichem iNKT TZR mit verschiedenen Vβ11 TCR & bgr; Ketten zu studieren Antigenerkennung von CD1d beschränkten invariant natürliche Killerzellen (iNKT) TZR, angewendet.
In allen Fällen konnten wir eine De – novo – Repertoire von TZR durch trans zu erzeugenGabe die zentrierte TCR hemichain zu peripheren T-Zellen Blut, wo die eingeführte hemichain mit dem endogenen TCR & agr; oder TCR & bgr; Gegenketten gepaart. Im Wesentlichen dient die zentrische hemichain als Köder, die verwendet werden können, die entsprechenden Gegen Ketten zu identifizieren, die, wenn sie miteinander gepaart TCRs bilden, die die Antigenspezifität von Interesse aufrechtzuerhalten, noch in Affinitäts variiert. Von diesen neuen Repertoires konnten wir klonotypischen TZR mit verbesserter Wechselwirkungsstärke gegen das Zielantigen zu isolieren, im Vergleich zu bereits bestehenden TZR. Deshalb glauben wir, diese Methode wird die Pipeline zu identifizieren optimale TZR für die klinische Anwendung zu beschleunigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die erste Voraussetzung für eine erfolgreiche Anwendung dieses Verfahrens ist das Erreichen ausreichender Transduktionseffizienz von primären T-Zellen mit dem hemichain von Interesse. Nach unserer Erfahrung ist die Kombination der Verwendung von PG13 als Verpackungszelllinie und pMX als retroviraler Vektor Ergebnisse in stabile und effiziente Expression des eingeführten Gens in humanen primären T-Zellen. PG13 Verpackungszellen können Einzelzelle für hochtitrige Verpackungszellen auszuwählen geklont sein Transdukt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 mL, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
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