비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동을 사용하여 인간의 MXA의 멀티 서브 유닛 단백질 복합체의 특성
Summary
This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.
Abstract
The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.
Introduction
단백질의 구조는 많은 급 세포 과정에서 중요한 역할을한다. 신호 전달 경로, 유전자 발현, 효소의 활성화 / 비활성화는 모두 단백질 복합체 1-4의 적절한 조립에 의존한다. 또한, 단일 – 또는 헤테로 올리고머라고도이 프로세스는 공유 비가역 또는 가역 정전 소수성 단백질 – 단백질 상호 작용에 기인한다. 올리고머는 게놈 크기를 증가시키지 않고 상이한 세포 과정을 다양 화하지만, 단백질 변성, 열화 (5)을 향해 더 내성 안정한 착물을 구축에도 전략을 제공 아닙니다. 올리고머에 결함이 단백질의 기능에 영향을 미치는 질병의 개발로 이어질 수있다. 예를 들어, 효소 페닐알라닌 수산화이 량체 복합체를 형성한다. 단백질 단지 내 일부 돌연변이는 사량 형성을 약화시키고 질병 페닐 케톤뇨증 (6)으로 이어질 수 있습니다.
<p class = "jove_content"> 인간의 MXA 단백질은 바이러스 다양한 RNA에 대한 광범위한 항 바이러스 활성을 발휘 이펙터 단백질과 DNA 바이러스 7을 유도 된 인터페론 (IFN)입니다. 그것은 dynamin 같은 대형 GTP 아제의 슈퍼 패밀리에 속한다 체외 8 큰 올리고머 구조를 형성 할 수있는 능력을 갖는다. 올리고머는 급속한 저하 9,10에서 MXA을 보호하기 위해 제안되었다. 많은 연구 그룹에 의해 집중적 노력에도 불구하고, 액션의 분자 메커니즘은 크게 어려운 유지 및 바이러스 기능 MXA의 올리고머 화 상태의 역할은 논쟁 9,11,12 중이다. 이와 관련하여, 가오와 동료 MXA 큰 링형 올리고머 구조 (11)의 형태 nucleoproteins 바이러스와의 상호 작용에 의해 항 바이러스 활성을 발휘하는 모델을 제안 하였다. 그러나,보다 최근에는 MXA 이량 체는 항 바이러스 활성을 나타내는 인플루엔자 바이러스 (12)의 핵 단백질과 상호 작용하는 것을 보여 주었다. 비MXA의 결정 구조에 ased 가오 동료는 시험 관내에서의 올리고머 및 바이러스 11,13 기능에 중요한 인터페이스 영역의 몇 아미노산 잔기를 확인 하였다. 따라서, 항 바이러스 활성을 나타낸다 MXA의 올리고머있는 상태 규명하기 위해, 우리는 급속 내인성 MXA는 IFNα 자극 후 발현뿐만 아니라 인간 세포에서 발현 MXA 인터페이스 돌연변이 oligmeric 상태를 결정하기위한 간단한 프로토콜을 설정하기 위해 노력했다.일반적으로 이러한 분할 녹색 형광 단백질과 같은 단백질 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 사용되는 많은 방법이 있지만 (분할-GFP) 상보성 분석 (14), 표면 플라스 몬 공명 (15) 및 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) (16)들은 제공하지 올리고머 단백질 복합체의 정확한 화학 양론의 정보를 제공합니다. 이 특정 측면의 조사, 기술 등멀티 앵글 광 산란 (MALS) 17 및 분석 초 원심 (18)는 매우 유용합니다. 일반적으로 이러한 방법을 사용하여 분석 한 단백질은 정제 된 단백질이다. 올리고머 화 공정은 또한 다른 세포 인자에 의존 할 수있다. 이러한 요인을 알 수있는 경우, 분석은 더욱 곤란하다. 또한, 일부 단백질은 E.에서 표현하기 어려운 대장균 및 정화. 따라서,이 방법은 세포 환경에서 단백질 올리고머를 분석 할 수있는 최적의 선택되지 않습니다. 또한, 이러한 기술은 용이하게 사용할 수있는 고가의 장비를 필요로한다.
비 변성 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE), 크기 배제 크로마토 그래피 또는 종래의 도데 실 황산나트륨 (SDS) -page 뒤에 화학적 가교 세포 용 해물 2,19,20에서 올리고머 형성의 특성을위한 유용한 도구이다. 이러한 방법은 전문 장비가 필요하지 않습니다 쉽게 체육 될 수 있습니다표준 실험실에서 rformed. 우리는 처음에 가변되지 않은 특정 집계와 MXA의 침전되었다 다양한 화학 가교 프로토콜을 평가 하였다. 따라서, 우리는 다음 비 변성 PAGE 프로토콜을 테스트했다. 비 – 변성 PAGE는 SDS의 사용을 배제 같이, 단백질의 이동은 그 나라의 전하에 의존한다. 블루 기본 페이지는 SDS 유사한 전반적인 음전하와 단백질을로드 쿠마 빛나는 푸른 G250을 사용하지만 단백질 (21) 변성하지 않습니다. 불행하게도, 높은 염 종종 용해 버퍼에 포함되는 가의 양이온 (예를 들어 Mg를 2+)의 존재 브릴리언트 블루 침전물을 쿠마. 사용 된 버퍼에 따라, 올리고머 단백질 복합체에 영향을 미칠 수있는 단계를 더 최적화없이 샘플을 분석하기 어려울 수있다.
여기에서 우리는의 올리고머를 결정하기 이전에 발행 된 방법 (22)에 기초한 간단한 프로토콜을 제시비 – 변성 PAGE를 사용하여 세포 용 해물로부터 유도 된 인간 MXA 단백질.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 웨스턴 블롯 분석 한 다음 비 변성 PAGE에 의해 포유 동물 세포에서 발현 된 단백질의 올리고머 상태의 빠른 결정을 할 수있는 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법의 중요한 이점은 주어진 단백질의 올리고머 상태 전에 단백질 정제없이 전체 세포 용 해물로부터 결정될 수 있다는 것이다. 이 올리고머 또는 보조 요인과 관련하여 그 기능을 발휘 단백질 중요 할 수있다. 또한, 단백?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a Grant from the Swiss National Science foundation (Grant nr. 31003A_143834) to JP.
Materials
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Pre-equilibrate in dialysis buffer ( if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011 |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, | Bio-Rad | 456-1083 | Pre-run in running buffer to adjust buffer system |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | use 1 tablet per 50 ml |
| PBS, pH 7.4 bottle a 500ml Gibco | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | toxic! wear gloves and protect eyes! |
| NativeMark Unstained Protein Standard 50ul | Invitrogen | P/N 57030 | load 5 ul/well |
| A549 cells | ATCC | ATCC CCL185 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| Vero cells | ATCC | ATCC CCL81 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| anti-Mx1 antibody | Novus Biologicals | H00004599_D01P | Use at a 1:1000 dilution |
| ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) | GE-Healthcare | NA934V | Use at a 1:10000 dilution |
| 0.5% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies | Thermo Fisher | 15400-054 | |
| Iodoacetamide 5g | Sigma-Aldrich | I-6125 | stock 100mM |
| Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies | Thermo Fisher Scientific | 41966-029 | |
| Pen Strep 100 x 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 15140 – 130 | |
| Glutamax 100xStock, 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 350500-038 | |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500ml Gibco Lot:42G9552K | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Cellulose filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| PVDV blotting membrane | GE-Healthcare | 10600022 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Biosolve | 0020092391BS | |
| sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | S-7920 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492015 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| Tween 20 | Calbiochem | 6555204 | |
| CHAPS 10% solution | Amresco | N907 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Glycine | Biosolve | 0007132391BS | |
| sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G7757 | |
| b-Glycerophospate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| Milk powder | Migros/Switzerland | ||
| Methanol | Millipore | 1.06009 | |
| sodium cloride (NaCl) | Sigma Aldrich | 71380 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Amresco | 288 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | L4509 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S-8045 |
References
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