Karakterisering van Multi-subunit eiwitcomplexen of Human MxA het gebruik van niet-denaturerende Polyacrylamide Gel-elektroforese

De quaternaire structuur van een eiwit speelt een cruciale rol in vele cellulaire processen. Signaalwegen, genexpressie en enzymactivering / deactivering allemaal afhankelijk van de juiste montage van eiwitcomplexen ^1-4. Dit proces ook bekend als homo- of hetero-oligomerisatie wordt veroorzaakt door irreversibele covalente of omkeerbare elektrostatische en hydrofobe eiwit-eiwit interacties. Oligomerisatie diversifieert niet alleen de verschillende cellulaire processen zonder genoomgrootte verhogen, maar ook een strategie voor eiwitten stabiele complexen die resistenter voor denaturatie en degradatie ⁵ zijn gebouwd. Defecten in oligomerisatie van invloed op de functie van eiwitten en kan leiden tot de ontwikkeling van ziekten. Bijvoorbeeld het enzym fenylalanine hydroxylase vormt een tetrameer complex. Sommige mutaties in het eiwitcomplex de vorming tetrameer verzwakken en leiden tot de ziekte fenylketonurie ^6.

<p class = "jove_content"> De menselijke MxA eiwit een interferon (IFN) geïnduceerde antivirale effectoreiwit uitoefenen van een brede antivirale activiteit tegen verschillende RNA en DNA-virussen ^7. Het behoort tot de superfamilie van dynamin-achtige GTPases groot en heeft de capaciteit om grote oligomere structuren in vitro ^8. Oligomerisatie is voorgesteld om MxA te beschermen tegen snelle afbraak ^9,10. Ondanks intensieve inspanningen van vele onderzoeksgroepen, de moleculaire werkingsmechanisme blijft grotendeels ongrijpbaar en de rol van de oligomerisatie toestand van MxA voor zijn antivirale functie is onder debat ^9,11,12. In dit verband, Gao en medewerkers voorgesteld een model waarbij MxA oefent zijn antivirale activiteit door interactie met virale kerneiwitten in vorm van grote ringachtige oligomere structuren ^11. Echter, meer recentelijk, hebben we aangetoond dat MxA dimeren vertonen antivirale werking en interactie met het nucleoproteïne van influenza A virus ^12. Based op de kristalstructuur van MxA, Gao en collega's identificeerden verschillende aminozuurresten in de grensvlakgebieden die essentieel zijn voor de oligomerisatie in vitro en zijn antivirale werking ^11,13 zijn. Teneinde op te helderen die oligomere toestand van MxA antivirale activiteit uitoefent, zochten wij een eenvoudig protocol om de oligmeric staat MxA interface-mutanten tot expressie gebracht in humane cellen als endogeen MxA uitgedrukt IFNa na stimulatie snel vast te stellen.

Hoewel er vele technieken die gewoonlijk worden gebruikt om de interactie tussen eiwitten bestuderen die de split-Green Fluorescent Protein (split-GFP) complementatie bepaling ^14, oppervlak plasmon resonantie ¹⁵ en Förster resonantie energieoverdracht (FRET) ^16, ze geen informatie over de exacte stoichiometrie van een oligomeer eiwitcomplex. Voor het onderzoek van dit aspect technieken zoalsmulti-angle lichtverstrooiing (Mals) ¹⁷ en analytische ultracentrifugatie ¹⁸ zijn zeer nuttig. Gewoonlijk zijn de eiwitten geanalyseerd met behulp van deze werkwijzen gezuiverde eiwitten. Oligomerisatie processen kunnen ook afhangen van andere cellulaire factoren. Als deze factoren zijn bekend, de analyse bemoeilijkt. Bovendien hebben sommige eiwitten moeilijk in E. coli en te zuiveren. Daarom zijn deze werkwijzen niet de optimale keuze eiwit oligomerisatie analyseren de cellulaire omgeving. Bovendien zijn deze technieken vereisen dure instrumenten die niet gemakkelijk beschikbaar zijn.

Niet-denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE), grootte-uitsluitingschromatografie of chemische verknoping gevolgd door gebruikelijke natrium dodecylsulfaat (SDS) -PAGE zijn nuttige hulpmiddelen voor het karakteriseren van de vorming van oligomeren van cellysaten ^2,19,20. Deze methoden vereisen geen gespecialiseerde apparatuur en kan gemakkelijk worden performed in een standaard laboratorium. We eerst geëvalueerd verschillende chemische verknoping protocollen die invariant tot aspecifieke aggregatie en precipitatie van MxA. Daarom hebben we de volgende geteste niet-denaturerende PAGE protocollen. Als niet-denaturerende PAGE gebruik van SDS uitsluit, de migratie van eiwitten afhankelijk van hun oorspronkelijke lading. Blauw-natieve PAGE gebruikt Coomassie brilliant blue G250 eiwitten met een totale negatieve lading, vergelijkbaar met SDS laden, maar niet het eiwit ²¹ denatureren. Helaas, Coomassie Brilliant blauw precipitaat in aanwezigheid van hoge zouten en tweewaardige kationen (bijvoorbeeld Mg ²⁺⁾ die vaak in lysis buffers. Afhankelijk van de gebruikte buffers, kan het moeilijk zijn om het monster zonder verdere optimalisering van stappen die een effect op het oligomeer eiwitcomplex konden analyseren.

Hier presenteren we een eenvoudig protocol op basis van een eerder gepubliceerde werkwijze ²² voor oligomerisatie van bepalenhuman MxA eiwit afkomstig van cellysaten met behulp van niet-denaturerende PAGE.