JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

RNA ölçülmesi için bir yöntem<em> K</em<sup> 6</supHücre ve dokularda> -methyladenosine Değişiklikler

Published: December 05, 2016
doi:
10.3791/54672
, ,
1Department of Cardiology,Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

Summary

RNA N 6 -methyladenosine (m 6 A) değişiklikleri ölçmek için bir değiştirilmiş Northern lekeleme yöntemi tarif edilmektedir. Geçerli yöntem çeşitli deneysel tasarımlar altında çeşitli RNA'lar modifikasyonlar ve kontrolleri tespit edebilir.

Abstract

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m6A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m6A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m6A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m6A modifications in various sources of RNA. While m6A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m6A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

Introduction

Dynamic and reversible RNA modifications have important roles in RNA homeostasis. Four decades ago, N6-methyladenosine (m6A) modifications were found to be abundant in eukaryotic transcriptomes1. They have diverse functions in messenger RNA (mRNA), ribosomal RNA (rRNA), small nucleolar RNA, transfer RNA, and microRNA2. The m6A modifications of mRNA influence their splicing3, translation4, degradation5, and localization2. Moreover, they affect ribosome biogenesis and microRNA function6. The evolutionary conservation of m6A modifications of RNA is noted in unicellular bacteria to multi-cellular humans7. Delineation of the roles of m6A modifications is currently under extensive exploration. The efforts are expected to provide new insights into transcription control. Recent studies reveal that other chemical modifications of mRNA8 also play critical roles in RNA metabolism.

Circadian rhythms9, stem cell pluripotency10, triglyceride metabolism4, fibrosis11, obesity12, and major depression13 are a few examples of processes where m6A modifications are known to control outcomes. Many circadian clock gene transcripts have m6A sites14. Modulation of m6A methylase or demethylase elicits circadian period changes15. Mettl3, an m6A transferase, is a regulator for stem cell pluripotency. A deficiency of Mettl3 leads to early embryonic lethality and aberrant lineage priming at the post-implantation stage10. A deficiency of fat mass- and obesity-associated (FTO), an m6A demethylase, in adipocytes affects fatty acid mobilization and body weight through posttranscriptional regulation of Angptl44. These studies reveal that m6A not only controls mRNA processing, but also plays critical roles in embryological development and patho-physiology. The function of m6A modifications holds implications for therapeutic considerations in the future.

Several methods are available to measure m6A modifications of RNA16-18. Traditionally, thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) are used to study the distribution of m6A in several RNAs19,20. Mass spectrometry is a sensitive tool for the detection of m6A modifications in RNA. However, the RNA needs to be excised by RNase into short fragments before analysis by mass spectrometry21. Methyl-RNA immunoprecipitation and sequencing (m6A-Seq)22 immunoprecipitates fragmented RNAs with m6A-specific antibodies and performs parallel RNA sequencing. This method generates transcriptome-wide m6A landscapes. High-resolution mapping of m6A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation (miCLIP) further maps m6A modifications at a single-nucleotide resolution23. Both methods provide details of m6A modification across the whole transcriptome, with specific genes’ information. However, quantifications and standardization in both methods are difficult if experiments require the comparison of multiple conditions. Moreover, fragmentations of RNA for m6A-Seq alter the original RNA structure, which may affect native m6A levels. To detect global m6A modifications of RNA and their changes under different experimental conditions, we report a method that employs a modified northern blotting protocol. This method resolves RNA by molecular weight, using gel electrophoresis18. This procedure provides better standardization and quantifications for experiments that involve multiple conditions or samples. It also provides specific m6A modification information for different RNAs, whether rRNA, mRNA, or microRNA.

Protocol

NOT: 6 A level rRNA, mRNA ve diğer küçük RNA'lar dahil toplam RNA m. Ribozomal RNA bol M 6 A değişiklikleri, 6 A seviyesi bu gerçeği dikkate almak gerekir m ölçümünü beri. 1. RNA İzolasyon (Kağıt havlu üzerine püskürtülen) ribonükleaz dekontaminasyon solüsyonu kullanarak, pipet ve laboratuar tezgah yüzeyleri silin. Islak kağıt nükleaz içermeyen su ile havlu ve tekrar pipet ve laboratuvar tezgah yüzeyleri silin. RNA Ekstraksiyonu Toplam RNA İzolasyon Bir kafa üstü karıştırıcı kullanılarak, doku, 50-100 mg ya da 4 ° C 'de muhafaza RNA izolasyon çözeltisi 1 mL 5-10 x 10 6 hücre homojenleştirin. Not: fazla doku (100-150 mg), çünkü burada daha düşük RNA konsantrasyonların farelerden adipoz doku örnekleri için gerekli olabilir. Örnekler fare kalp, karaciğer, iskelet kası, akciğer, beyin kaynaklı ve makrofajlar, daha önce 4 kullanılmıştır. İçindeOda sıcaklığında 5 dakika boyunca numune homojenatları cubate. Örnek homojenat 1 ml başına 1-bromo-3-kloropropan (BCP) 100 mcL ekleyin. 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır tüpleri ve üretici talimatlarına 24'e göre, toplam RNA izole etmek için devam edin. İzole edilmiş toplam RNA'dan poliadenile mRNA Saflaştırma olarak temin edilebilen kitler veya protokoller kullanılarak poliadenile edilmiş mRNA'nın arındırın. Aşağıdaki çözeltinin her yeniden askıya iyice çalkalanır: 2x bağlama çözeltisi, oligo (dT) polistiren boncuklar ve yıkama solüsyonu. oligo (dT) kullanılmadan önce oda sıcaklığına getirin boncuk emin olun. bir ısıtma bloğu içinde 70 ° C'de bir boru ve ısıya hazırlık başına elüsyon çözeltisi 120 uL aktarın. Bir mikrosantrifüj tüpe toplam RNA 500 mg kadar pipetle. nükleaz içermeyen su ile 250 mcL ses seviyesini ayarlamak. toplam RNA 2x bağlayıcı çözeltisi 250 uL ekleyin böylecedökülmesinden ve vorteks kısaca içeriğini karıştırmak için. oligo 15 mcL ekleyin (dT) boncuk ve vorteks iyice karıştırın. 3 dakika boyunca 70 ° C'de inkübe karışımı. Isıtma bloğu numuneyi çıkarın ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilir. 2 dakika için 15,000 x g'de santrifüjleyin. Dikkatle arkasında yaklaşık 50 uL bırakarak süpernatant kaldırmak. pipetleme pelet yeniden askıya yıkama solüsyonu 500 mcL ekleyin. Bir spin filtre / toplama tüpü kümesine süspansiyonu pipetle. 2 dakika için 15,000 x g'de santrifüjleyin. toplama tüpünden sütunu kaldırmak ve flow-through atın. toplama tüpüne sütun dönün. Spin filtre üzerine yıkama solüsyonu Pipet 500 uL. 15.000 x santrifüj 2 dakika boyunca örn. taze toplama tüpüne sıkma filtre aktarın. Elüsyon çözeltisi pipetle 50 uL ısıtıldı70 ° C'ye kadar eğirme filtrenin merkezi üzerine. 70 ° C'de 2-5 dakika boyunca inkübe edin. 1 dakika için 15,000 x g'de santrifüjleyin. Spin filtrenin merkezi üzerine 70 ° C'ye kadar ısıtıldı elüsyon çözeltisi ilave 50 uL pipetle. Tekrarlayın Adım 1.2.2.1.18. 100 ug / mL glikojen, 3 M sodyum asetat tamponu (pH 5.2), ve mutlak etanolün 2.5 hacim 0.1 hacim. -80 ° C de bir gece hızlandırabilir. 4 ° C'de 25 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüjleyin. süpernatant atın. % 75 etanol içindeki 1 ml pelet yıkayın. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüjleyin. Dikkatlice etanol çıkarın. 3-5 dakika boyunca hava içinde kurutulur. pelet çözmek için nükleaz içermeyen su 10 uL ekleyin. -70 ° C'de saklayın. RNA Yeterlilik ve miktarının belirlenmesi Bir spektrofotometre kullanılarak, Notl RNA konsantrasyonunu belirlemek260 nm ve 280 nm 'de absorbans ng. A 260 / A 280 oranı 1.8-2.2 olmalıdır. % 0.8 agaroz jel elektroforezi 25 kullanılarak RNA örnek kalitesini kontrol edin. NOT: sağlam ökaryotik toplam RNA yoğun 28S ve 18S rRNA bantları göstermesi gerekir. İyi bir RNA preparasyonu için 18S rRNA bandı şiddeti ile 28S oranı ~ 2. 2. Jel Elektroforez ve Transferi NOT: Tampon hazırlama protokolleri Tablo 1'de verilmiştir. Formaldehid jel hazırlanması (% 1) diethylpyrocarbonate (DEPC) su ile tüm elektroforez cihazları durulayın. Tamamen bir mikrodalga fırınında DEPC su 215 mL agaroz 2.5 g eritin. 10x 3- (N-morfolino) propansülfonik asit (MOPS), 12.5 ml tampon ve% 37 formaldehid 22.5 ml. 1.5 mm kalınlığında tarak ile elektroforez cihazının içine dökün. t kabarcıkları ortadan kaldırmak veya itmekTemiz bir tarak ile jel kenarlarına hem. Jel, oda sıcaklığında katılaşmaya izin verin. Örnek hazırlama örnek tamponu toplam RNA 1-10 ug ve 11.3 uL karıştırın. örnek tampon 11.3 uL RNA işaretleyici (1 mcg / ml) 2 ug karıştırın. 16 uL bir toplam hacimde 2.2.1 ve 2.2.2 örnekler nükleaz içermeyen su ilave edilir. 5 dakika boyunca 60 ° C de ısı ve daha sonra buzda. buz üzerinde / ul etidyum bromür 0.1 ug içeren izleme boya 4 uL ile 2.2.3 den örnek 16 mcL karıştırın. DİKKAT: Solunduğunda Ethidium bromür muhtemelen teratojenik ve toksiktir. etidyum bromür güvenlik formu okuyun. Elektroforez 10x MOPS 200 mL 1x MOPS çalışan tampon yapmak için GKD 2 O 1.800 ml tampon ekleyin. jel kuyu durulayın 1x MOPS çalışan tampon kullanın. Ön-run tO 5 dakika boyunca 20 V jel. Jelin kuyuların içine RNA örnekleri yükleyin. Işık maruz kalmasını önlemek için folyo ile örtün. (Gece ​​boyunca) yaklaşık 17 saat süre ile 35 V çalıştır Incelemek ve bir UV ışığı altında jel fotoğrafını. transfer Kullanılmayan kısmı kaldırmak için jel kesti. 10x SSC tamponu (20x SSC tamponu 250 mL DEPC su 250 mL) 500 mL hazırlayın. 50 rpm'de sallama ile 20 dakika için 10 x SSC tamponu ile iki kere jel yıkayın. Transfer tepsi (Şekil 1) transfer tamponu emen bir fitil kağıt, olarak hizmet verecek kadar büyük 1 filtre kağıdı sayfasını kesin. jel aynı boyutta filtre kağıdı 4 parça kesin. jel aynı boyuta pozitif yüklü bir naylon zar 1 sayfa kesin. jel üzerinde çentik ve, uygun yönlenmesinin sağlanması için bir işaretleyici olarak membran işaretleyin. 15 dakika boyunca 2 x SSC tamponu membran bekletin. 500 ml o dökünf 10x SSC transferi tepsisine tampon. cam levha üzerinde büyük filtre kağıdı sayfasını Lay ve transfer tamponu ile filtre kağıdı ıslatın. Bir pipet yardımıyla kabarcıkları dışarı rulo. transfer tamponuna önceden kesilmiş filtre kağıdı 2 adet ıslatın ve adım 2.4.5 filtre kağıdının ortasına koyun. herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak. aşağı filtre kağıdı üzerinde jel üst yan yattı. jel üstünde membran yerleştirin. jel ve membran çentikler aynı hizaya getirin. membran üstüne önceden kesilmiş filtre kağıdı 2 adet koyun ve transfer tamponu ile filtre kağıdı ıslatın. tabakalar arasındaki herhangi bir baloncukları giderin. havlu sadece jel ve zarından geçen tampon kadar emmek emin olmak için jel etrafında plastik wrap uygulayın. Filtre kağıdı üzerine kağıt havlu Stack. havlunun üstünde bir büyük boy cam plaka koyun. yığının üstüne bir ağırlık yerleştirin. RNA membrana jelden transfer etmek için gece boyunca devam edin. N 6 -methyladenosine 3. Algılama membran Çapraz bağlama 2x SSC tamponu nemli membran tutun. UV çapraz bağlayıcı içine 10x SSC tamponu ile dalmış filtre kağıdı 2 yaprak yerleştirin. RNA adsorbe tarafı yukarı bakacak şekilde, filtre kağıdının üstüne membran yerleştirin. "Autocrosslink modu" (120,000 μJ) seçin ve ışınlama başlatmak için "Başlat" düğmesine basın. membrana jelden RNA transferi onaylamak için UV jel görüntü alıcı ile membran ve jel inceleyin. Bağışıklık 1 saat boyunca oda sıcaklığında Tween 20 (TBST) tampon Tris-tamponlu tuzlu su içinde% 5 yağsız süt içinde membran engeller. 15 dakika boyunca TBST tamponu ile üç kez yıkayın. Gecede m 6 A (membran inkübe <em> K 6 -methyladenosine) antikor çözeltisi (1: 1000,% 5 yağsız süt TBST tamponu) 4 ° C'de ilave edildi. 15 dakika boyunca TBST tamponu ile üç kez membran yıkayın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca (% 5 yağsız süt TBST tamponu içinde 2.000: 1) HRP ile konjüge edilmiş eşek anti-tavşan antikoru çözelti içinde membran inkübe edin. 15 dakika boyunca TBST tamponu ile üç kez membran yıkayın. Gelişmiş kemiluminesans substrat (membran cm2 başına 0.125 ml) uygulayın. Imalatçının talimatlarına 26 göre bir dijital kamera optimum ayarlarla kemilüminesans yakalar. m 6 A Niceleme ImageJ yazılımı kullanarak göreceli m 6 A kemilüminesan yoğunluğunu ölçmek. ImageJ yazılım menüsü altında ilgili dosyayı açmak için "Dosya" seçeneğini seçin. ImageJ gelen "Dikdörtgen" aracını seçin ve etrafında bir çerçeve çizinsinyaller. Ribozomal RNA deneyleri odağı değilse, hesaplama için 18S ve 28S ribozomal RNA m 6 A bantları kaçının. Seçilen şeritli onaylamak için "Command" ve "1" i tıklayın. Basın "Command" ve "3" Seçilen komplo göstermek için. "Düz" aracını tıklayın ve parçalı alanı ayırmak için çizgiler çizmek. ölçümleri kaydetmek için "Wand" aracını tıklayın. veri verir. Etidyum bromür boyama gelen 18S ribozomal RNA bant ile m 6 A düzeylerini normale.

Representative Results

Normal ışık-karanlık sirkadiyen fazda 14 gün sonra, vahşi tip farelerde sürekli karanlıkta yerleştirildi. karaciğer RNA'lar 4 saat aralıklarla numune ve modifiye Northern blot ile incelenmiştir. RRNA, mRNA ve küçük RNA'ların metilasyonu açık (Şekil 2) tespit edilmiştir. Farklı sirkadiyen saatler arasında karşılaştırma (BT) doğru 18S rRNA standardı ile hesaplanabilir. RRNA, mRNA ve küçük RNA'lar m 6 A düzeylerinin sağlam sirkadiyen salınım oldu. rRNA tarafından Sunulan girişimi önlemek için, poliadenile edilmiş RNA'lar aşama 1.2.2 gibi saflaştırılabilir. Saflaştırmadan sonra, rRNA, büyük ölçüde diğer RNA'lar (Şekil 3) daha iyi bir görünüm için izin ortadan kaldırılabilir. <stron g> Şekil 1: leke aktarma ünitesi montajı. zara RNA kurutma için kılcal aktarım ünitesi gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2: C57BL / 6J fareler m 6 A düzeyleri günlük ritim. Bu rakam, m 6 vahşi tip farelerin karaciğer toplam RNA'nın bir leke 4 saat aralıklarla normal ışık-karanlık fazın 14 gün sonra koyu, koyu fazının ilk gününde kurban gösterir. Miktar m 6 18S ve 28S rRNA arasındaki görüntü yoğunluk farkı kullanılarak yapıldı. M 6 A bolluk altındaki formaldehit jelden 18S rRNA bandına normalize edildi.et = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 3: ya rRNA olmadan m 6 A lekeler. Örnek m toplam RNA ve vahşi tip fare karaciğerinde poliadenile RNA 6 bir blotlar gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 1 10x MOPS tampon (pH 7.0, ışıktan koruma) MOPS 41.85 g 0.2 M Sodyum asetat 4.1 g 0.05 M EDTA, disodyum tuzu 3.7 g 0.01 M DEPC su Genel Toplam 1 L oda sıcaklığında karışmaya 2 20x SSC tamponu (pH 7.0) Sodyum klorit 175.3 g 3 M trisodyum sitrat 88.3 g 0.3 M DEPC su Genel Toplam 1 L </td> Oda sıcaklığında karıştırdıktan sonra otoklav 3 takip Boya 10x MOPS tamponu 500 ul 1x Ficoll 400 0.75 g % 15 mavi Bromophenol 0.01 g % 0.2 Ksilen siyanol 0.01 g % 0.2 DEPC su Genel Toplam 5 mL -20 ° C'de de 4 DEPC su 1'den oranı sulandırmak: DEPC ve 1,000 GKD 2 O Gece boyunca oda sıcaklığında karıştırdıktan sonra otoklav 5 Örnek tamponu (ışıktan korumak) 10x MOPS tamponu 200 ul % 37 formaldehid 270 ul formamid 660 ul -20 ° C'de de </tbody> Tablo 1: Tampon ve çözümleri.

Discussion

Modifications of RNA have important roles in cellular function and physiology. The current understanding of the regulation, function, and homeostasis of these modifications is still being explored and expanded8. Therefore, a precise and gold-standard method to evaluate the modifications of RNA is needed. The modified northern blotting method provides precise quantification of RNA modifications and clear delineation of the modifications in diverse RNAs. Although the method requires at least 3 days, it can be standardized and can be used in various experimental designs. Moreover, with different antibodies, it can detect different RNA modifications27.

It is important to separate different RNAs when analyzing RNA modifications. Ribosomal RNA comprises a large portion of the total amount of RNA28,29. The results from analyzing RNA modifications only in total RNA will represent mostly the changes of rRNA. Methylation and other such modifications of rRNA could potentially mask the changes in other RNAs. With the procedure of gel separation, the modifications of mRNA and other small RNAs can be more accurately analyzed.

Transcriptome-wide mapping with m6A immunoprecipitation and sequencing provides detailed insight into the modification of each type of RNA22. It provides information on the specific RNAs and a resolution of around 80-120 bp. Although m6A-Seq can compare the modifications between different experimental conditions, the selection of proper standards and controls for such experiments is difficult18. Immunoprecipitation is difficult to reproduce, often giving significant variations amongst repeats. Moreover, m6A-Seq requires the fragmentation of RNA samples before immunoprecipitation and sequencing30. The fragmentation process could potentially induce undue influences on the original RNA modifications. If the experiment does not need the specific gene’s information but requires different conditions for comparison, the current method provides better visualization and control for diverse experimental setups.

Modification of RNA is an important step in regulating transcriptional control31. However, the homeostasis and the regulatory mechanisms of various RNA modifications under diverse physiological realms are still unclear. Using the present modified northern blotting method, different RNA modifications can be quantified and compared. Furthermore, the changes and regulations of RNA modifications can be investigated in greater detail. In the future, it could also be possible to combine the experimental data from both the classical northern blotting and the modified northern blotting protocols, providing greater insights into RNA biology.

The most important factor determining the success of the modified northern blotting protocol is the integrity of the RNA sample. RNAs with some amount of degradation may yield good classical northern blotting results, but this could potentially have significant impact on the modified northern blotting results. The modifications of RNA in different tissues or cell lines could also vary significantly. It is important to test the suitable RNA sample loads for different tissues before performing the final experiments.

As blotting procedures have been traditionally named after Dr. Southern and different geographical directions, we propose the name “northeastern” blotting for the current technique.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

C.Y.W. received support from the National Health Research Institute (NHRI-EX101-9925SC), the National Science Council (101-2314-B-182-100-MY3, 101-2314-B-182A-009), and Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG3B1643, CMRPG3D1002, CMRPG3D0581, CMRPG380091, and CMRPG3C1763).

Materials

RNaseZap solution Ambion AM9782 Protocol 1.1
TRI Reagent solution Ambion AM9738 Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP) Sigma B9673 Protocol 1.2.1.3
Ethanol JTbaker 8006 Protocol 1.2.1.3
Isopropanol Sigma I9516 Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit Sigma MRN70 Protocol 1.2.2.1
Glycogen Ambion AM9510 Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate Fluka 71183 Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water Ambion AM9930 Protocol 1.2.2.6
DEPC Sigma D5758 Protocol 2.1.1
Agarose JT Baker A426 Protocol 2.1.2
MOPS Sigma M1254 Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution Sigma F8775 Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt JT Baker 8993 Protocol 2.1.3 10X MOPS buffer
formamide Sigma F7503 Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker Ambion AM7150 Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide Amresco X328 Protocol 2.2.5
Ficoll 400 GE Healthcare 17-0300-10 Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue Sigma 114391 Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol Sigma X4126 Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride JT Baker 3624 Protocol 2.4.2 20X SSC buffer
Trisodium citrate Sigma S1804 Protocol 2.4.2 20X SSC buffer
filter paper GE Healthcare RPN6101M Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane GE Healthcare RPN303B Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400 Stratagene 400075 Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500 ANT Technology Gel Catcher 1500 Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine) Synaptic Systems 202003 Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab GE Healthcare NA934 Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System BIO-RAD 1708280 Protocol 3.2.8
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thammana, P., Held, W. A. Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro. Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).
  2. Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).
  3. Niu, Y., et al. N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).
  4. Wang, C. Y., et al. Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism. Sci Signal. 8 (407), 127 (2015).
  5. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  6. Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One. 10 (2), 0118438 (2015).
  7. Deng, X., et al. Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).
  8. Dominissini, D., et al. The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. , (2016).
  9. Fustin, J. M., et al. RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock. Cell. 155 (4), 793-806 (2013).
  10. Geula, S., et al. Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation. Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).
  11. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. , (2016).
  12. Jia, G., et al. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).
  13. Du, T., et al. An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population. J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).
  14. Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome. Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).
  15. Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription. Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).
  16. Heyn, H., Esteller, M. An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine. Cell. 161 (4), 710-713 (2015).
  17. Xiao, W., et al. Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing. Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).
  18. Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3′ UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  19. Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).
  20. Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).
  21. Golovina, A. Y., et al. Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis. Nucleic Acids Res. 42 (4), 27 (2014).
  22. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  23. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  24. Fu, L., et al. Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method. Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).
  25. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445 (2010).
  26. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. 6, 18874 (2016).
  27. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome. Nat Chem Biol. , (2016).
  28. Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons. J Vis Exp. (90), (2014).
  29. Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq. J Vis Exp. (74), (2013).
  30. Mishima, E., et al. Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides. PLoS One. 10 (11), 0143756 (2015).
  31. Klungland, A., Dahl, J. A. Dynamic RNA modifications in disease. Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).

Tags

RNA N6-methyladenosineRNA EpigeneticsNorthern BlottingRNA ModificationsN6A DetectionRNA IsolationAgarose Gel ElectrophoresisMOPS BufferFormaldehydeSSC BufferRNA Transfer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wang, C., Lin, M., Su, H. A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (118), e54672, doi:10.3791/54672 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image