Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

Cellen een veelheid van biomacromoleculen die voortdurend met elkaar. Deze associatie ontstaat complexen die deelnemen aan de cellulaire routes die verantwoordelijk zijn voor hun functioneren in signaaltransductie, regulatie van genexpressie en celmigratie onder andere. Alle proteïne-proteïne interacties die optreden in een cel omvatten een netwerk, bekend als interactoom. In Saccharomyces cerevisiae is aangetoond dat meer dan 70% van de eiwitten interagerende partners ¹ hebben. Inzicht in de interactoom van een cel en hun functies relevante informatie over de complexiteit en diversiteit van levende organismen. Verschillende methoden zijn beschreven geïdentificeerd en gekarakteriseerd eiwit-eiwit interacties. Verschillende hoog door te zetten methoden zoals gist two-hybrid ^2, eiwit-fragment complementatie assays ^3, affiniteitszuivering ⁴ gekoppeld aan massaspectrometrie en eiwitten microarrays worden gebruikt om een interactie ^5,6 identificeren. Eenmaal geïdentificeerd, is het nodig om het te bevestigen en kan variëren van geval tot geval. Kenmerkend voor deze experimenten omvatten het verstoren van de interactie zelf op het niveau van de individuele leden van de interactie paar, bijvoorbeeld door gen deletie of overexpressie van één van de eiwitten, en vervolgens naar veranderingen in de eigenschappen of functie van het andere lid van het cellulair niveau. Vervolgens biofysische technieken ⁷ worden gebruikt om de eiwit-eiwit interactie te karakteriseren op moleculair niveau. Daartoe is de structuur van eiwitcomplexen worden bepaald door röntgenkristallografie, kernspinresonantie en cryo-elektronenmicroscopie terwijl calorimetrie en fluorescentie spectroscopie worden gebruikt om ze kwantitatief en mechanistisch beschrijven.

In dit werk werd fluorescentie anisotropie gebruikt als een techniek om de wisselwerking karakteriseren tussen de GTPase EFL1 en SBDS-eiwit. Deze eiwitten deel aan de synthese van ribosomen door het bevorderen van de afgifte van eukaryote initiatie factor 6 van het oppervlak van de 60S ribosomale subeenheid ^8. De SBDS eiwit is gemuteerd in een ziekte bekend als de Shwachman-Diamond Syndroom ⁹ en fungeert als een guanine nucleotide exchange factor voor EFL1 verlagen van de affiniteit voor guanosinedifosfaat ^10,11. Disease mutaties in SBDS afschaffing van de interactie met EFL1 en daarmee te voorkomen dat de activering.

Fluorescentie anisotropie wordt algemeen gebruikt in biologische toepassingen eiwit-peptide of eiwit-nucleïnezuur interacties te bestuderen. Het is gebaseerd op het principe dat een fluorofoor geëxciteerd met gepolariseerd licht resulteert in een gedeeltelijk gepolariseerde emissie. Fluorescentie anisotropie wordt gedefinieerd door Vergelijking 1:

waar ik _vv en ik _VH zijn defluorescentie-intensiteiten van de verticaal _(VV) en horizontaal _(VH) gepolariseerde emissie wanneer het monster is enthousiast met verticaal licht ¹² gepolariseerd. Fluorescentie anisotropie is gevoelig voor factoren die de snelheid van de rotatiediffusie van de fluorofoor beïnvloeden en derhalve afhankelijk van de temperatuur, de viscositeit van de oplossing en de schijnbare molecuulgrootte van de fluorofoor. De schijnbare grootte van een eiwit dat een fluorofoor toeneemt bij interactie met een ander eiwit en dergelijke veranderingen kunnen vervolgens worden beoordeeld als een verandering van anisotropie. Meer specifiek zal een fluorofoor die langzaam roteert in oplossing ten opzichte van de fluorescentie levensduur grote I _VV waarde en kleine ik _VH waarde en dus een relatief grote anisotropie vertonen. Voor fluoroforen die snel in verhouding tot hun fluorescerende leven tuimelen, ik _vv en ik _VH zal vergelijkbaar zijn en hun anisotropie waarde klein zijn ¹² </sup> (Figuur 1). Bovendien, voor een goede anisotropie signaal geluidsmeting, is het noodzakelijk om een ​​fluorofoor een fluorescentie levensduur vergelijkbaar met de rotatiecorrelatietijd van het molecuul van belang hebben. Anders is het niet mogelijk om het verschil in anisotropie tussen vrij proteïne en dat in het complex een accurate. Bijvoorbeeld, de anisotropie van een fluorescerende probe met een levensduur bijna 4 nsec zoals fluoresceïne of rhodamine bevestigd aan een laag gewicht verbinding met 100 Da molecuulgewicht is 0,05. Binding aan een molecuul van 160 kDa zal de anisotropie waarde te verhogen tot 0,29; een verschil dat nauwkeurig kan worden gemeten. Daarentegen zullen dezelfde fluorescerende probe betrokken in een bindingsreactie waarvan de toename van moleculaire grootte varieert van 65 tot 1000 kDa alleen tot een verandering anisotropie van 0,28 tot 0,3, die te klein nauwkeurig te meten. In dit scenario zou een sonde met een levensduur van 400 nanoseconden meer geschikt ¹² zijn.

Fluorescentietoepassingen vereisen de aanwezigheid van een fluorofoor in elk van de moleculen bestudeerd. Bestuderen eiwit-eiwit interacties zijn er drie type fluoroforen: 1) het tryptofaan residuen in de eiwitten, 2) chemisch gebonden fluoroforen en 3) fluorescerende fusiepartners zoals groen fluorescent eiwit (GFP) en derivatieven. De meeste eiwitten hebben tryptofaan residuen van de structuur, waardoor de gemakkelijkste manier om een ​​interactie te meten is door het bewaken van de veranderingen in de overeenkomstige fluorescentie spectra of door het bewaken veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van het tryptofaan residuen. Evenwel tryptofaan residuen in beide eiwitten compliceert de analyse. Anderzijds, een fluorofoor de fluorescerende eigenschappen veranderen als gevolg van een interactie moet worden op of vlakbij de bindingsplaats en het kan interfereren met de interactie zelf. Dit heeft speciale aandacht nodig bij het gebruik van omvangrijke fluoroforen zoals GFP. Als geen van deze fluoroforen kunnen worden gebruikt voor bindingsstudies moet dan extrinsieke fluoroforen voeren aan die van de betrokken eiwitten. Vele chemisch gesynthetiseerde fluoroforen aanwezig en kunnen covalent worden gehecht aan proteïnen via hun reactieve groepen zoals aminogroepen (zijketen van lysines of N-terminus) en de thiolgroepen in cysteine. Fluorophore derivaten met isothiocyanaat en succinimidyl esters reageren met amidegroepen terwijl joodacetamide en maleimide zijn thiol-reactieve groepen ^13. De meest voorkomende kleurstoffen in fluorescentietoepassingen zijn derivaten van de fluoresceïne en de rhodamine groene kleurstoffen, coumarines, BODIPY fluoroforen en Alexa Fluor kleurstoffen. Een gedetailleerde lijst van in de handel verkrijgbare fluoroforen en het gebruik ervan kan worden gevonden in de referenties ^14,15. Voor succesvolle labeling, moet de reactieve groep wordt blootgesteld aan het oppervlak van het proteïne, maar door het grote aantal reactieve functionele groepen typisch in polypeptiden is het erg moeilijk om plaatsspecifieke modificatie krijgen. Het eiwit van belang in dit onderzoek SBDS bevat 5 cysteïnes vrij en 33 lysines die kunnen leiden tot multisite labeling. Niet-uniforme etikettering kan de binding beïnvloeden en zal data-analyse compliceren als verschillende fluorofoor moleculen verschillende fluorescentie-intensiteit signalen bij binding kan uitlokken. om overcome dit probleem, gebruikten we de flitser fluorofoor, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-vl) fluoresceïne aan de site-directe label de SBDS eiwit. Dit is een arseenoxide kleurstof met een hoge affiniteit voor vier cysteïnen gescheiden in een motief bekend als flash-tag bestaat uit de sequentie CCXXCC waarbij X elk aminozuur behalve cysteïne ^16,17. Dit tetracysteine ​​motief wordt toegevoegd aan de N- of C-terminus van het eiwit door genetische manipulatie met een geschikte linker aan de verstoring van de algehele vouw van het eiwit te voorkomen. Het paar bestaande uit Flash kleurstof en flash-tag werd oorspronkelijk ontworpen om plaatsspecifieke label eiwitten in levende cellen ¹⁷ maar het kan ook worden gebruikt om gezuiverde eiwitten in vitro labelen zoals hier toegelicht. Daarnaast zijn ook enzymatische strategieën ontwikkeld om plaatsspecifieke functionalisering van eiwitten ¹⁸ mogelijk.

In dit manuscript beschrijven we de bruikbaarheid van een fluorescentie anisotropiesa instrument om eiwit-eiwitinteracties. Binding kan worden beoordeeld door een eenvoudige inspectie van de binding curve vorm, terwijl kwantitatieve informatie kan worden verkregen bij de pasvorm van de experimentele gegevens.