We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.
Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.
Antistoffer som kan bretting og fungerer i det intracellulære miljø er lovende verktøy for både forskning og terapeutiske anvendelser. De har evnen til å modulere proteinaktivitet ved å binde til en mål-protein i cellene for å forhindre protein-protein interaksjoner, avbryte innvirkningen mellom protein-nukleinsyre-interaksjoner, eller forhindre substrat adgang til enzymer 1-5.
Selv om antistoffene har mye potensial for intracellulære anvendelser, å konstruere dem for riktig folding og oppløselighet i den intracellulære miljøet samtidig som evnen til å binde til en mål-antigen er utfordrende. Den reduserende miljø cytoplasmatiske hindrer dannelsen av disulfidbindingene som normalt kreves for stabil folding av full-lengde antistoffer og antistoff-fragmenter, inkludert enkeltkjedevariabel-fragment (scFv) antistoffer 6,7. En rekke rettet evolusjon tilnærminger har blitt brukt til å konstruere antistoffer med high slektskap for målet antigener 8-10. Disse metodene vanligvis bruker fag display, gjær overflate display, eller bakteriell overflaten skjerm til skjerm store biblioteker av antistoffer 11-13. Disse metodene er kraftige og effektive for å identifisere antistoffer som binder seg til mål, men de er avhengig av sekretoriske vei for å transportere proteiner som skal vises 14-16. Den sekretoriske vei translocates utfoldet proteiner fra redusere cytoplasma inn i det endoplasmatiske retikulum lumen i gjær eller inn periplasmaet i bakterier. Proteinene deretter kaste under oksiderende betingelser og vises på celleoverflaten eller pakket inn i fagpartikler å screene for binding affinitet 17,18. Som et resultat, vil antistoffer som er isolert ved hjelp av disse teknikkene ikke nødvendigvis å brette godt i cytoplasmaet, og intracellulær oppløselighet må ofte være konstruert separat hvis antistoffene vil bli brukt i intracellulære anvendelser.
Å forbedreeffektiviteten av tekniske antistoffer som er godt brettes i cytoplasma, vi tidligere har rapportert suksess for MAD-TRAP (membran-forankret display for Tat-baserte gjenkjennelse til å forbinde seg proteiner), en fremgangsmåte for screening av et scFv-antistoff-bibliotek ved bruk av Escherichia coli Inner- membran skjerm 19. Bakteriell indre membran-skjerm er avhengig av tvilling-arginin trans (TAT) vei for å transportere vist antistoffer, i motsetning til andre vanlig visningsmetoder som bruker den sekretoriske vei. Den Tat veien inneholder en kvalitetskontroll mekanisme som bare tillater løselig, korrekt foldet protein for å bli transportert fra E. coli cytoplasma, tvers over den indre membran, og inn i periplasma 20,21. Overexpressed Tat-substrater (f.eks., Proteiner som er målrettet mot Tat vei med en N-terminal fusjon til Tat signalpeptidet ssTorA) som er godt foldet i cytoplasma danner en langlivet transmellomproduktet med den N-terminale ende in cytoplasma og den C-terminale enden i periplasmaet 19. Dette tillater visning av korrekt foldede Tat underlag, som antistoff-fragmenter, i det periplasmatiske flate av E. coli indre membran. Etter å ha fjernet den ytre membran ved enzymatisk fordøyelse for å generere sferoplaster, blir antistoffer eksponert til det ekstracellulære rommet (figur 1). Dette gjør at Tat substrater som vises på den indre membran som skal siktes for binding til et bestemt mål. Viktigere, utnytte Tat vei for celle-overflate-skjerm sikrer at bare de antistoffer i biblioteket som er godt foldet i cytoplasma vil bli avhørt for binding, slik at samtidig prosjektering av bindende affinitet og intracellulær folding. I denne protokollen beskriver vi hvordan du kan vise en scFv bibliotek på E. coli indre membran, panorere biblioteket mot et målantigen, og utføre en andre screening for å identifisere de mest lovende bestanddelene i biblioteket. Mens vi fokuserer protokollen på scFvs, kan metoden brukes til å konstruere noen protein som applikasjonen krever binding og intracellulær folding.
Figur 1. Tat indre membran display. I E. coli, er scFv-antistoff som er uttrykt som en fusjon til den ssTorA signalsekvensen og korrekt foldet i cytoplasma transporteres gjennom den indre membran. En transmellomformer, hvor scFv er forankret i den indre membran med den N-terminale ende i cytoplasma og den C-terminale enden i periplasmaet. E. coli ytre membran blir enzymatisk spaltet under dannelse av sfæroplaster, for derved å eksponere de forankrede antistoffer mot det ekstracellulære rom og gjør dem tilgjengelige for deteksjon ved hjelp av et antistoff som binder til den C-terminalt smeltet epitop tag på den viste antistoff.belastning / 54583 / 54583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ingeniør antistoffer til cytoplasmisk aktivitet er en vanskelig oppgave på grunn av den reduserende miljø i cytoplasma, noe som hindrer dannelsen av stabiliserende disulfidbindinger 6,7. Dette forårsaker de fleste antistoffer til cytoplasmisk være inaktiv med mindre de er konstruert for stabilitet og oppløselighet i cytoplasma, i tillegg til å være konstruert for bindingsaffinitet. De eksisterende metoder for fag-display, bakteriell overflate display, og gjær overflatevisningsmetoder alle bruke den sekretoriske vei 14-16 for visning av konstruerte antistoffer, men disse fremgangsmåter har ingen midler for å ingeniør intracellulær folding. Antistoffer konstruert ved hjelp av indre-membran skjerm har forbedret cytoplasmisk stabilitet og oppløselighet fordi brette kvalitetskontroll av Tat vei hindrer translokasjon av antistoffer som er dårlig brettes og ustabile i cytoplasma. Denne metoden forenkler iterativ prosess med prosjektering intracellulære antistoffer for affinitet ennd oppløselighet, som de to eiendommene er konstruert i ett trinn. Selv om denne metoden er designet for å konstruere antistoffer med oppløselighet i reduksjons intracellulære miljø, kan det også anvendes på tekniske antistoffer til å fungere på ikke-reduserende betingelser, ettersom proteinene utviklet ved hjelp av denne metode opprettholde sin folding i det oksiderende miljøet i periplasmaet.
Selv om denne teknikken forenkler prosessen med å konstruere antistoffer med høy affinitet og høy cytoplasmatiske oppløselighet, flere begrensninger er viktig å vurdere når du bruker denne protokollen. Når du analyserer de sekundære skjermen ELISA-signaler for å identifisere lovende scFv varianter, er terskelen for kresne mellom potensielt interessante varianter og de som kanskje ikke utviser tilstrekkelig antigen-binding sannsynligvis ikke klart før etter flere kloner er blitt ytterligere karakterisert. Det er viktig å lete etter bedret binding i løpet av stam-antistoffet; derimot,et unormalt høyt signal kunne være en indikasjon på aviditet 29 eller aggregering effekter 30, en utfordring som ikke er unik for den indre membran-skjerm screening tilnærming. En viktig begrensning for å huske når du bruker denne protokollen er manglende evne til å gjenopprette sferoplaster etter panorering, som de er ukurant (upubliserte data). Dette nødvendiggjør DNA-amplifiseringen og transformasjon fremgangsmåte for å gjenopprette de antistoff-kodende plasmider.
Flere kritiske trinnene i protokollen muliggjør samtidig prosjektering av folding og binding av antistoffer. For screening for å være vellykket, må scFv-biblioteket blir screenet uttrykkes som en fusjon til den ssTorA signalpeptidet. Uten denne sekvensen, blir antistoffene ikke rettes til Tat reaksjonsveien og vil således ikke bli translokert til periplasmaet 19. I tillegg er det viktig at en C-terminal epitop tag er kondensert til antistoffene for å tillate påvisning av de viste antistoffer i hyllending analyser. Det er klart at E. coli stamme som brukes til å uttrykke scFvs må også ha den nødvendige Tat vei maskiner, men dette er sant av den brukte E. coli-stammer.
Endringer i denne protokollen er mulig å forbedre sitt potensial for å isolere antistoffer med de ønskede egenskaper. En subtraktiv panorering skritt kan være ferdig før panorering mot målet antigen å utarme scFv bibliotek av ikke-ønskede bestanddeler. Biblioteket sfæroplastene kan inkuberes med magnetiske kuler belagt med BCCP alene eller belagt med en ikke-ønsket protein, og sfæroplastene som binder til disse perler kan kastes før screening av de gjenværende ubundne sfæroplaster for binding til det ønskede mål. Som nevnt i de representative resultater, til en metode for å forbedre affiniteten av en isolert scFv er å inkludere et oppløselig konkurrent i panorering reaksjon for å konkurrere med de scFv vises på sfæroplastene. Fordi løselig kompetitor er et renset protein, ikke DNA er amplifisert fra det, slik at bare sekvensene til scFv vises på sfæroplastene vil bli gjenvunnet i PCR-reaksjonen. I tillegg kan denne metoden bli utvidet til å konstruere andre typer av antistoffer eller til ikke-antistoff-bindende proteiner.
E. coli indre membran skjermen er en kraftig plattform for ingeniør antistoffer med høy affinitet og høye nivåer av intracellulær oppløselighet. Denne fremgangsmåte er særlig egnet for effektiv prosjektering av antistoffer som virker på den intracellulære miljø. Disse intracellulære antistoffer er allerede utforsket som potensielle legemiddelselskap i en rekke felt, inkludert nevrodegenerative sykdommer, kreft og virale infeksjoner 31. Denne teknikken vil gjøre mer utbredt bruk av intracellulære antistoffer som verktøy for forskning og medisin i disse feltene, og alle andre felt hvor studere et protein mål in situ er ønsket.
The authors have nothing to disclose.
We thank Tomer Zohar for work on scFv screening and characterization assays. A portion of this work was supported by award number F32CA150622 from the National Cancer Institute (to AJK). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Cancer Institute or the National Institutes of Health.
scFv library | Varies | N/A | A suitable scFv library should be obtained from a commercial or academic source. |
MC4100 E. coli cells | Coli Genetic Stock Center | 6152 | Cells need to be chemically competent or electrocompetent, depending on the selected transformation method. |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
Difco dehydrated culture media LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | BD | 244610 | |
Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP1521 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5 M | Fisher Scientific | BP2482-500 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
Lysozyme | Sigma Aldrich | L3790-10X1ML | |
Vortex mixer | VWR | 97043-564 | |
Bicine | Fisher Scientific | BP2646100 | |
D-Biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher Scientific | BP1755-1 | |
BugBuster Master Mix (cell lysis detergent) | EMD Millipore | 71456 | |
Vivaspin 2 MWCO, 3000 daltons | GE Healthcare Sciences | 28932240 | |
Target antigen | Varies | N/A | Purified target antigen may be purchased or produced/purified. |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen | 65601 | |
Dynamag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
Tube rotator | VWR | 13916-822 | |
PCR primers | IDT | N/A | Primer sequences are as described in the protocol. |
10X T4 DNA ligase reaction buffer | New England BioLabs | B0202S | |
T4 Polynucelotide kinase (PNK) | New England BioLabs | M0201S | Make sure the T4 ligase buffer used in the primer phosphorylation reaction contains 1 mM ATP. |
5X Phusion HF buffer pack | New England BioLabs | B0518S | |
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix, 10 mM each dNTP | New England BioLabs | N0447L | |
Phusion DNA polymerase | New England BioLabs | M0530S | Other high-fidelity polymerases may be used as an alternative, but the annealing temperature in Table 3 must be adjusted. |
C1000 Touch thermal cycler with dual 48/48 fast reaction module | Bio-Rad | 185-1148 | |
Agarose | Promega | V3121 | |
SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
Wizard SV gel and PCR clean-up system | Promega | A9281 | |
T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202S | |
Microdialysis membrane filter | EMD Millipore | VSWP04700 | |
Agar | BD | 214030 | |
96-well polystyrene round-bottom cell culture plates | VWR | 10062-902 | |
Costar general polystyrene assay plate lids | Corning | 3931 | |
Microtitre plate shaker | VWR | 12620-926 | |
Costar 96 well EIA/RIA Easy Wash clear flat bottom polystyrene high bind microplate | Corning | 3369 | |
Bel-blotter polycarbonate 96-well replicating tool | Bel-Art Products | 378760002 | |
Instant nonfat dry milk | Quality Biological | A614-1000 | |
Tween 20 (polysorbate 20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
PopCulture reagent (concentrated cell lysis detergent) | EMD Millipore | 71092-3 | |
Monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidase(HRP) antibody produced in mouse | Sigma Aldrich | A8592 | |
SigmaFast OPD | Sigma Aldrich | P9187-50SET | |
Sulfuric acid (H2SO4), 10N solution | Fisher Scientific | SA200-1 | |
Reynolds Wrap aluminum foil | VWR | 89079-075 | |
BioTek Epoch microplate spectrophotometer | Fisher Scientific | 11120570 |