L'isolement, la différenciation, et la quantification des anticorps humain sécrétant des cellules B du sang: ELISpot comme indicateur fonctionnel de humorale Immunité

les cellules B jouent un rôle central dans le développement de l'immunité humorale. Ils se développent d'abord dans la moelle osseuse et entrent dans la circulation sanguine sous forme de cellules B naïves, qui peuvent migrer dans les tissus lymphoïdes, tels que la rate, les ganglions lymphatiques et amygdales, pour un développement ultérieur. Après Ag rencontre, certaines cellules B naïves migrent dans les follicules lymphoïdes, où les cellules du centre germinatif B peuvent se différencier en cellules de mémoire B et plasmoblastes (PBS) / cellules plasmatiques (PC). Alors que la plupart du PBS / PC de sortie dans le flux de sang, quelques éventuellement résident dans la moelle osseuse à subir une différenciation terminale dans les PC à long terme ^1. Les cellules B en circulation sont hétérogènes, et à l' état d' équilibre, PB / PC sont rares dans le sang périphérique ^2. En raison de la disponibilité de marqueurs de surface spécifiques à la lignée, la cytométrie de flux est devenue une méthode populaire pour l'identification et la caractérisation des sous-ensembles de cellules B dans le sang périphérique. Une application prolongée de cytometr de fluxy est l'addition d'une fonction de tri de cellules, ce qui permet la séparation et l'isolement des sous-ensembles individuels de cellules B avec une pureté élevée. Sur la base de l'expression de récepteurs de surface spécifiques à différents stades de développement, des cellules B humaines en circulation sont généralement classés en trois sous – populations principales: les cellules B naïves (CD19 ⁺ CD27 ^– CD38 ^-), de cellules B à mémoire (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^-), et PB / PC (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^{+) 3-4} (Figure 1). Les cellules B naïves, par nature, ne sont pas rencontrées Ags. Cependant, ils peuvent être différenciées en cellules IgM ⁺ CD27 ⁺ B mémoire. Bien que les cellules B naïves sont homogènes en exprimant le récepteur de l' antigène des lymphocytes B (BCR) -Associated molécules (par exemple, CD19, CD20 et CD22) , ils sont hétérogènes dans leur répertoire d' immunoglobulines ^5. La majorité des cellules CD27 ⁺ B mémoires peuvent être différenciées en CD27+ / CD38 ⁺ salut PB / PC ^6. En outre, les cellules B mémoires et PB / PC sont polyclonaux et présentent une hétérogénéité de développement et fonctionnelle ^4-7. PB / PC en circulation sont normalement de courte durée et n'expriment CD138, mais celles faites à installer dans la moelle osseuse sera terminale différencier et de devenir à long terme. Terminally PC différenciées expriment CD138 et régulent les molécules de CD27 sur leurs surfaces ^8. Étant donné que PB et PC sont capables de sécréter Abs, dans de nombreuses occasions, ils sont collectivement désignées comme ASCs. En revanche, ni les cellules B naïves ni les cellules B mémoires peuvent produire des quantités appréciables de Abs ^9-10. Néanmoins, lorsqu'il est isolé, les deux cellules B naïves et mémoires peuvent être différenciées en ASCs en 3 – 10 jours lorsqu'il est placé dans les conditions de culture appropriées ^{6, 11-15.} En fait, ASCs dérivés d'actions in vitro de différenciation expressions de surface similaires de CD27 et CD38 avec ceux fr directement isoléle sang périphérique om ^6. En outre, les ASCs différenciées in vitro expriment un faible niveau de CD20 de surface, comme celle de circulation PB / PC ^6. Bien que les ASCs de culture dérivés sont de courte durée, ils peuvent sécrètent Abs, ce qui indique qu'ils sont fonctionnellement compétents et capables de contribuer à l'immunité humorale.

Les deux ELISA et ELISpot sont de loin les méthodes les plus couramment appliquées avec qui pour obtenir des informations fonctionnelles sur la réponse immunitaire humorale. ELISA est un test basé sur une plaque de 96 puits, et il est souvent utilisé pour mesurer les titres de sérum Abs Ag-spécifique et d' autres analytes (par exemple, des cytokines). Il est commode et évolutive. ELISA est conçu pour utiliser un dosage enzymatique en phase solide pour détecter la présence d'Ac ou d' autres substances, telles que le sérum, dans un échantillon liquide ^16. Les lectures de tests ELISA sériques ont été largement utilisés pour représenter la réponse immunitaire du corps. Un outil nécessaire pour l'acquisition de readouts de dosages ELISA est un lecteur de microplaques spectrophotométrique. Le lecteur peut déterminer la densité optique (DO) des produits finaux résultant généralement de la réaction de la peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à Abs de détection et de leurs substrats spécifiques ^17. En ce qui concerne le rapport de la réponse immunitaire humorale, les taux sériques Ab déterminés par ELISA indiquent le collectif, mais pas individuelle, le rendement de l'ASC dans le corps. En outre, ELISA ne tient pas compte de la participation par les cellules B de mémoire, qui ne sécrètent pas Abs.

Comme ELISA, ELISpot est une méthode largement utilisée pour détecter et surveiller la réponse immunitaire dans des échantillons de sang périphérique ^17-18. ELISpot est une technique liée à un ELISA en sandwich. Dans ce document, les cellules sont placées dans le difluorure de polyvinylidène (PVDF) puits de membranes-backed de microplaques de 96 puits pour une culture à court terme. Le test ELISPOT est analogue à effectuer un transfert de Western sur une microplaque et developing, les taches sur la membrane de PVDF dans chaque puits. Un système de lecteur ELISpot automatisé ou un stéréomicroscope pour le comptage manuel est nécessaire. Le principal avantage d'un test ELISPOT pour la détection d'une réponse immunitaire est sa sensibilité exceptionnelle à la quantification des ASC et des cellules sécrétant des cytokines. Il rend compte de leurs activités fonctionnelles dans l'immunité humorale et cellulaire, respectivement. Dans la mesure de la fonction immunitaire humorale, les taux sériques Ab déterminés par ELISA et le nombre de ASCs énumérés par ELISpot sont souvent corrélées, mais les lectures de données de ces deux essais ont des différences dans les implications fonctionnelles ^19-20. Le principal avantage de ELISpot est sa sensibilité de la méthode. Le niveau de titres Ab sériques tel que rapporté par ELISA est présenté comme semi-quantitative des lectures de DO, indiquant le niveau Ab relative, ou plus quantitative, comme les lectures de concentration lorsqu'une quantité connue des isotypes appropriés de Abs est inclus pour référence. En revanche, les résultats d'un test ELISPOT sont presented comme le nombre absolu de ASCs dans un pool de cellules d'intérêt (par exemple, des cellules non fractionnées périphériques mononucléaires du sang (PBMC) et des cellules B purifiées à partir de PBMC). ELISpot peut détecter une seule ASC, mais nécessite des quantités ELISA Ab à partir ASCs pour atteindre des concentrations d'essai dépendant optimisées avant la mesure. Par conséquent, ELISpot est évidemment supérieure à ELISA de la sensibilité de la quantification. En outre, ELISpot est également adapté pour quantifier les ASCs différenciées in vitro à partir de cellules B à mémoire activés. les cellules mémoire B ne sécrètent pas Abs, mais peuvent se différencier en ASCs lors de l'activation; ils ont donc aucune contribution à Abs sériques détectés par ELISA. Ainsi, ELISpot est la méthode de choix pour la mesure de la réponse immunitaire des cellules circulantes B mémoires après son activation en culture. Elle permet la surveillance de l'entretien d'une immunité humorale à long terme.