הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות
Summary
Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.
Abstract
המאפיין העיקרי של חסינות לחות הוא ליצור ASCs התפקודית, אשר לסנתז ולהפריש Abs הספציפי לאנטיגן (Ag), כגון פתוגן, ומשמש הגנה מארחת. לקביעת כמותי של המצב התפקודי של התגובה החיסונית הלחות של אדם, הן Abs בסרום ASCs במחזור נמדדים בכינויו readouts פונקציונלי. אצל בני אדם, דם היקפיים הוא מדגם הנוחה ביותר ונגיש בקלות, שניתן להשתמש בהם לצורך קביעת התגובה החיסונית הלחות שהושרו על ידי תאי B המארח. B-cell ברור תת, כולל ASCs, ניתן לבודד ישירות מדם היקפי באמצעות בחירה עם microbeads שושלת ספציפית Ab מצומדות או באמצעות מיון תא עם cytometry זרימה. יתר על כן, תאי B נאיביים וזיכרון מטוהרים יכולים להיות מופעל בדיל לתוך ASCs בתרבות. הפעילות התפקודית של ASCs לתרום הפרשת Ab ניתן לכמת על ידי ELISPOT, המהווה assay כי מתכנס אנזיםassay immunoabsorbance -linked (ELISA) וטכנולוגיות מערביות סופג כדי לאפשר הספירה של ASCs הנפרד ברמת התא הבודד. בפועל, assay ELISPOT נעשה שימוש יותר ויותר להעריך יעילות החיסון בגלל הקלות של טיפול של מספר רב של דגימות דם. שיטות לבודד תאי B האדם מן הדם ההיקפיים, את הבידול של תאי B לתוך ASCs במבחנה, ואת העסקתם של ELISPOT כימות של IgM- סך IgG-ASCs שיתואר כאן.
Introduction
תאי B למלא תפקיד מרכזי בפיתוח של חסינות לחות. בהתחלה הוא לפתח במח העצם ולהיכנס לזרם הדם כמו תאי B נאיביים, אשר ניתן להעביר לתוך הרקמות הלימפה, כמו הטחול, בלוטות הלימפה, ואת שקדים, להמשך פיתוח. לאחר מפגש Ag, כמה תאי B נאיביים לנדוד לתוך זקיקי הלימפה, שם מרכז נבטי תאי B יכולים להתמיין לתאי B זיכרון plasmablasts (PBS) / תאי פלזמה (מחשבים). בעוד שרוב PBS / מחשבי היציאה לתוך זרם הדם, כמה בסופו של דבר להתגורר במח העצם כדי לעבור התמיינות מסוף מחשבי חיים ארוכים 1. תאי B שבמחזור הם הטרוגניות, ו על מצב יציב, מחשבי PBS / הם נדירים בדם היקפי 2. כתוצאת הזמינות של סמני משטח ספציפי שושלת, cytometry זרימה הפכה שיטה פופולרית לזיהוי והאפיון של תת B-cell בדם היקפי. יישום מורחב של הזרימה cytometry הוא התוספת של פונקצית סדרן תא, המאפשרת פרדה ובידוד של תת בודדים של תאי B עם טוהר גבוה. בהתבסס על הביטוי של קולטנים משטח ספציפי בשלבים התפתחותיים שונים, תאי B במחזור האדם מסווגים בדרך כלל לשלוש תת-אוכלוסיות עיקריות: תאי B נאיבי (CD19 + CD27 – CD38 -), תאי B זיכרון (CD19 + CD27 + CD38 -), ו PBS / מחשבים (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (איור 1). תאי B נאיביים מטבעו לא נתקלו AGS. עם זאת, הם יכולים להיות מובחנים לתוך IgM + CD27 + תאי הזיכרון B. למרות שתאי B נאיבי הם הומוגניים בהבעת הקולטן לאנטיגן B-cell (BCR) מולקולות -associated (למשל, CD19, CD20 ו CD22) הם הטרוגניים ברפרטואר אימונוגלובולינים שלהם 5. רוב תאי B זיכרון CD27 + יכול להיות מובחן לתוך CD27+ / היי CD38 + PBS / מחשבים 6. בנוסף, תאי B זיכרון PBS / מחשבים הם polyclonal ולהציג ההטרוגניות התפתחותית תפקודית 4-7. PBS / מחשבים שבמחזור הם בדרך כלל קצרי מועד מחווי CD138, אבל אלה שנעשו להתיישב במח עצם סופנים יבדילו ולהיות קבוע לטווח ארוך. סופני מחשבים הבדיל להביע CD138 ולמטה להסדיר מולקולות CD27 על פני השטח שלהן 8. מאז הוא PBS ומחשבים מסוגלים מפריש Abs, בהזדמנויות רבות הם מסומנים קולקטיביים ASCs. לעומת זאת, לא תאי B נאיביים ולא תאי B זיכרון יכול לייצר כמות ניכרת של שרירי הבטן 9-10. אף על פי כן, כאשר מבודד, הן תאי B נאיביים וזיכרון יכולים להיות מובחנים לתוך ASCs ב 3 – 10 ימים כאשר הניחו את תנאי התרבות הנכונים 6, 11-15. למעשה, ASCs נגזר ביטויי משטח דומים נתח בידול במבחנה של CD27 ו CD38 עם אלה fr ישירות המבודדדם 6 היקפי אום. בנוסף, ASCs הבדיל במבחנה להביע רמה נמוכה של CD20 השטח, בדומה לזה של מחזורי PBS / מחשבים 6. למרות ASCs נגזרת התרבות היא כל קצרת מועד, הם יכולים להפריש Abs, המציין כי הם תפקודיים מוכשרים ומסוגלים לתרום חסינויות לחות.
שניהם ELISA ו ELISPOT הוא ללא ספק השיטות ביותר מיושם כלל עם אשר להשיג מידע פונקציונלי על תגובת הלחות החיסונית. ELISA הוא assay 96-היטב מבוססי צלחת, והוא משמש לעתים קרובות כדי למדוד את טיטר של שרירי הבטן בסרום Ag ספציפיים analytes אחרים (למשל, ציטוקינים). זה נוח, וניתן להרחבה. ELISA נועד להשתמש assay אנזים מוצק שלב כדי לזהות הנוכחות של שרירי בטן או חומרים אחרים, כגון סרום, במדגם נוזל 16. המצגים מ ELISAs בסרום היו בשימוש נרחב לייצג את התגובה החיסונית של הגוף. כלי הכרחי לרכישה מחדשadouts מבחני ELISA הוא קורא microplate spectrophotometric. הקורא יכול לקבוע את הצפיפות האופטית (OD) של מוצרי הקצה בדרך כלל בעקבות התגובה של peroxidase חזרת (HRP) Abs זיהוי מצומדות ו -17 מצעים הספציפיים שלהם. באשר לדיווח תגובת הלחות החיסונית, רמות Ab בסרום שקבעו ELISA לציין הקולקטיב, אבל לא אישית, ההישגים של ASCs בגוף. בנוסף, ELISA אינה מביאה בחשבון את ההשתתפות ידי תאי B זיכרון, אשר לא מפרישים Abs.
כמו ELISA, ELISPOT היא שיטה בשימוש נרחב לאיתור וניטור התגובה החיסונית בדגימות דם היקפיים 17-18. ELISPOT היא טכניקה הקשורים כריך ELISA. בכל זאת, התאים ממוקמים לתוך difluoride polyvinylidene (PVDF) בארות מגובי הממברנה של 96 גם microplates לתרבות לטווח קצר. את assay ELISPOT משול ביצוע המערבי סופג על microplate ואת developing הכתם על הממברנה PVDF בכל טוב. מערכת קורא אוטומטית ELISPOT או סטראו עבור ספירה ידנית נדרשת. היתרון העיקרי של ELISPOT באיתור תגובה חיסונית הוא הרגישות המעולה שלה כימות של ASCs ותאי ציטוקינים, מפריש. הוא מדווח פעילויות הפעילות שלהן חסינות הלחות ואת הסלולר, בהתאמה. במדידת תפקוד הלחות חיסונית, רמות Ab בסרום שקבעו ELISA ומספר ASCs שמפרטת ELISPOT מתואמות לעתים קרובות, אבל readouts הנתונים משני מבחנים אלה יש כמה בדלי השלכות פונקציונליות 19-20. היתרון העיקרי של ELISPOT הוא רגישותו של השיטה. רמת טיטר בסרום Ab כפי שדווחה על ידי ELISA מוצגת חצי כמותית כמו readouts OD, המציינת את רמת Ab יחסית, או יותר באופן כמותי, כפי readouts ריכוז כאשר כמות ידועה של isotypes התקין של שרירי הבטן נכללה לעיון. לעומת זאת, התוצאות של ELISPOT הם presenteד כמספר מוחלט של ASCs בתוך שלולית התא של עניין (למשל, תאי דם היקפיים mononuclear unfractionated (PBMCs) ותאי B מטוהרים מן PBMCs). ELISPOT יכול לזהות ASC יחיד, אבל ELISA דורש כמויות Ab מ ASCs להגיע ריכוזי assay התלוי אופטימיזציה לפני המדידה. לפיכך, ELISPOT הוא ללא ספק עדיף על ELISA ברגישות של כימות. יתר על כן, ELISPOT מתאים גם לכימות במבחנה ASCs הבדיל מתאי B זיכרון מופעל. תאי B זיכרון לא מפרישים Abs אבל יכול להתמיין ASCs באקטיבציה; הם ולכן אין תרומה Abs בסרום זוהה על ידי ELISA. לפיכך, ELISPOT היא השיטה של בחירה במדידה של התגובה החיסונית של תאי B זיכרון לאחר ההפעלה בתרבות. היא מאפשרת ניטור של החזקת חסינות הלחות לטווח ארוך.
Protocol
Representative Results
Discussion
בידוד וטיהור של אדם תאי הדם ההיקפי B
בדרך כלל, RBCs ניתן מקרע ביעילות מסומן על ידי חיץ תמוגה (שלב 1.2). חשוב לא כדי לדגור PBMCs עם למאגר תמוגה RBC יותר מ -5 דקות, כפי כדאיות התא עלול להיות מושפע אמוניום כלוריד. לחלופין, RBCs וטסיות ניתן להסיר זמני?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.
Materials
| BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 ml tube |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
| IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
| Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
| 15 ml Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
| Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
| Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
| Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
| Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
| Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
| Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
| Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
| Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
| Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
| biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
| CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
| Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
| Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
| Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
| Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
| MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
| BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
| BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
| Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
| Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
| Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-095 | |
| Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
| Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
| BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
| C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |
References
- Bemark, M. Translating transitions – how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
- Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
- Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
- Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
- Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
- Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
- Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81 (2011).
- Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108 (2014).
- Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
- Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
- Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
- Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
- Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806 (2012).
- Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
- Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
- Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Coligan, J. E. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
- Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
- Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403 (2016).
- Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
- Heine, G., Sims, G. P., Worm, M., Lipsky, P. E., Radbruch, A., Coligan, J. E. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
- Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
- Thornton, A. M., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
- Bohnhorst, J. &. #. 2. 1. 6. ;., Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren’s syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
- Bleesing, J. J., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
- Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
- Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
- Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
- Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
- Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
- Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
- Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
- Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
- Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
- Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
- Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972 (2009).
- Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
- Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).
