सीडी 4 की तैयारी<sup> +</sup> माइक्रोस्कोपी द्वारा GD3 और GD2 ganglioside झिल्ली अभिव्यक्ति का विश्लेषण के लिए टी कोशिकाओं
Summary
हम माइक्रोस्कोपी में उपयोग झिल्ली अभिव्यक्ति और आराम में gangliosides और सक्रिय मानव भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं के स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए एक मानक एंटीबॉडी धुंधला प्रोटोकॉल का वर्णन। इसके अलावा वर्णित हैं वास्तविक समय पीसीआर प्रयोगों 40,000 कोशिकाओं है कि अतिरिक्त कम इनपुट शाही सेना किट की आवश्यकता नहीं है का उपयोग कर <।
Abstract
निलंबन में तरीकों भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं की सक्रियता के लिए यहाँ बताया और confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए coverslips में उनके पालन, कि पूरक अभिव्यक्ति प्रयोगों की रूपरेखा प्रवाह cytometry जैसे स्थानिक स्थानीयकरण और सीडी 4+ टी सेल सक्रियण में शामिल gangliosides के दृश्य की अनुमति, पश्चिमी सोख्ता या वास्तविक समय पीसीआर। फ्लो और माइक्रोस्कोपी के माध्यम से उनके सेलुलर स्थानीयकरण के माध्यम से ganglioside अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव उच्च आत्मीयता और विशिष्टता के साथ विरोधी ganglioside एंटीबॉडी के उपयोग के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। बहरहाल, निलंबन में कोशिकाओं की एक पर्याप्त हैंडलिंग संस्कृति प्लेटों के इलाज के लिए आवश्यक प्रतिदीप्ति या confocal माइक्रोस्कोपी अधिग्रहण के लिए आवश्यक पालन को बढ़ावा देने के लिए शामिल है। इस काम में, हम भोले सीडी 4+ टी सेल सक्रियण के दौरान GD3 और GD2 ganglioside अभिव्यक्ति और TCR के साथ colocalization का निर्धारण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इसके अलावा, वास्तविक टी40,000 कोशिकाओं का उपयोग <IME पीसीआर प्रयोगों GD3 और GM2 / GD2 synthase जीनों के निर्धारण के लिए वर्णित हैं, प्रदर्शन है कि जीन विश्लेषण प्रयोगों कोशिकाओं की कम संख्या के साथ और अतिरिक्त कम इनपुट शाही सेना किट की आवश्यकता के बिना किया जा सकता है।
Introduction
सीडी 4+ टी कोशिकाओं प्रतिजन कोशिकाओं 1 से सक्रियता के बाद उनकी प्रेरक कार्यों के माध्यम से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया आर्केस्ट्रा। सेलुलर तंत्र है कि सक्रियण के दौरान संग्राहक हैं का अध्ययन प्रतिरक्षा समारोह की एक बुनियादी प्रक्रिया में अंतर्दृष्टि की अनुमति देता है। हालांकि, भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं के अध्ययन जटिल हो सकता है, क्योंकि वे रक्त परिधि 2 में कोशिकाओं का एक बहुत ही छोटी सी आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं।
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कई रिपोर्टों अलग सीडी 4+ टी सेल सक्रियण में शामिल अणुओं, मुख्य रूप से प्लाज्मा झिल्ली से 3 जुड़े प्रोटीन का स्थानीयकरण का अध्ययन किया है। Gangliosides सियालिक एसिड युक्त glycosphingolipids हैं और हालांकि वे बड़े पैमाने पर तंत्रिका कोशिकाओं, जहां वे इस तरह के प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में प्रचुर मात्रा में है, अन्य कोशिकाओं रहे हैं में अध्ययन किया गया है भी जैविक रूप से प्रासंगिक कार्यों 4,5 के साथ gangliosides व्यक्त करते हैं। हम पहले Tha सूचना दीमानव भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं की सक्रियता ST8Sia 1 (GD3 synthase) और GM2 / GD2 synthase sialyltransferase α2,8 की एक अपरेगुलेशन है दौरान टी, कि GD2 के महत्वपूर्ण सतह neoexpression और GD3 ganglioside 6 की upregulation प्रेरित। प्रतिरक्षा कोशिकाओं में GD3, GD2 और अन्य gangliosides के आगे के अध्ययन के लिए एक प्रोटीन आधारित प्रतिरक्षा समारोह का आंशिक दृश्य पूरक करने के लिए आवश्यक है।
आमतौर पर, ganglioside अभिव्यक्ति के अध्ययन में इस तरह पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) 7 के रूप में तकनीक पर आधारित है, लेकिन इस तकनीक प्लाज्मा झिल्ली में या subcellular डिब्बों में gangliosides के स्थानिक स्थानीयकरण अनुमति नहीं है, जैविक विश्लेषण सीमित।
इस काम में, हम विरोधी CD3 / विरोधी CD28 सक्रियता के बाद मानव भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं और PBMCs में एंटीबॉडी की मध्यस्थता की पहचान और GD3 और GD2 gangliosides के स्थानीयकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल यह मैं के साथयह भी संभव है उच्च गुणवत्ता के चित्र 6 के अधिग्रहण के साथ निलंबन में कोशिकाओं की कम संख्या में जीन और gangliosides की आणविक अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए, लिम्फोसाइटों के छोटे आकार (9 माइक्रोन) पर विचार।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल सीडी 4+ टी कोशिकाओं या अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं (जैसे, PMBCs, चित्रा 5) कोशिकाओं की एक छोटी संख्या से शुरू की सेल निलंबन में gangliosides या प्रोटीन स्थानीयकरण करने के लिए इस्तेमाल कि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. José Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Temática Glicociencia en Salud – CONACYT (253596).
Materials
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
- Mazzon, C., Viola, A. From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse. Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).
- Hamann, D., Pa Baars, ., Hooibrink, B., van Lier, R. W. Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms. Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).
- Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation. Biomed Res Int. , 276498 (2013).
- Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation. Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).
- Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).
- Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters. Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).
- Müthing, J. TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids. Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- O’Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).
- Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).
- Marconi, S., Acler, M., et al. Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients. Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).
- Park, J. E., Wu, D. Y., et al. Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand. Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).
- Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis. Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).
- Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex. J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).
- Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control. Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).
- Yamashiro, S., Okada, M., et al. Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes. Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).
- Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes. Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).
- Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody. J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).
