Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.
The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2´-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.
核ゲノムのほかに、各真核細胞はまた、ミトコンドリアマトリックス中の小さな環状DNAのコピー数千人が含まれています。ミトコンドリアDNA(mtDNAの)は電子伝達鎖の必須のサブユニットをコードするが、ミトコンドリアDNAの複製および転写のためのすべての因子を含むミトコンドリアプロテオームの大部分は、核ゲノムによってコードされています。継承のメンデル法則を次の核ゲノムとは対照的に、動物のミトコンドリアゲノムは母方の家系が独占的に継承されます。したがって、ミトコンドリアDNAが増殖し、女性の卵母細胞を介して、世代から世代へと伝達され、どのように理解することが基本的に重要です。しかし、ミトコンドリアDNAの複製は女性の生殖細胞系列に調節されている方法を超える継続的な議論があります。また、mtDNAの伝送のための広く受け入れられたmtDNAのボトルネック理論は、始原生殖細胞におけるミトコンドリアDNAの集団は比較的少数ドゥリンにサブサンプリングされることを示唆していますグラムの開発1 2。また、ミトコンドリアDNAの複製は、時間的および空間的に卵形成の間に調節されることを意味します。したがって、生殖系列発達中のミトコンドリアDNA複製のその場での検出は、ミトコンドリアDNAの継承のメカニズムの理解を容易にします。
ショウジョウバエの卵形成は、ミトコンドリアDNAの複製および送信を研究するための遺伝的に扱いやすいシステムを提供します。 2 ショウジョウバエ卵巣の各々において、産卵の機能単位であるovarioles 3と呼ばれる卵室16-20独立した文字列は、( 図1Aを参照)があります。各卵巣管は、前方先端が胚腺と呼ばれる構造で構成されている卵形成の漸進的な線形組織を、含まれています。胚腺はさらに、異なる発生段階の胚細胞を含む4つの領域に分割されています。領域1においては、生殖細胞系列幹細胞は、Cとして知られている娘細胞を産生するために、非対称分裂を経ますystoblasts。領域2aは、それらの最終的な分裂を完了したcystoblastsが含まれています。 Cystoblasts除算産16セル群の4ラウンドを受けます。 16細胞は、リング運河と呼ばれる細胞質ブリッジによって相互に接続されたまま。他の15の倍数体ナース細胞として発展しつつ細胞のみの1は、卵母細胞などの分化にコミットします。 fusomeとして知られている本質的な細胞質の構造は、リング運河の形成を促進する嚢胞極性及びナース細胞-卵母細胞相互作用4,5を決定することが提案されています。嚢胞は、領域2bに向かって移動すると、嚢胞構造が胚腺の幅全体に及ぶ、そしてより多くの毛包細胞に関連になります。胚腺の構成は、第1の新進卵室を含む領域3で終了します。その後、卵室は14の形態学的に異なる段階で卵巣管を経て進行胚腺の後端に組み付けられています。卵母細胞の成長はWH、ナース細胞に依存します卵母細胞へリング運河を経由してICH輸送タンパク質、mRNAおよび内膜構造( 例えば 、ゴルジ)。 ショウジョウバエの卵形成時には、それが各16セル嚢胞内のミトコンドリアの画分はfusomeに関連していたことが判明した、リング運河を通って移動し、Balbiani本体6と呼ばれる大きな塊で、単一の卵母細胞に送達しました。この現象は、女性の卵巣を介してミトコンドリア遺伝の品質管理に貢献することが提案されました。
ミトコンドリアDNA合成の検出は、細胞DNAへの標識DNA前駆体の取り込みに依存しています。伝統的に、チミジン、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)のヌクレオシド類似体は、組織培養細胞7,8内のmtDNAの複製を標識するために使用しました。しかし、抗体ベースのBrdU標識は、特に、全マウント組織染色のために、いくつかの制限を示します。 BrdU標識の1つの主要な欠点は、それが露出するようにDNAの変性を必要とすることですBrdUのエピトープは、抗BrdU抗体によって検出することができます。試料は、化学物質( 例えば、塩酸またはメタノールと酢酸の混合物)のような過酷な変性条件下で処理する必要があり、熱、または消化試料の構造を破壊し、以下の染色手順9を複雑にし得るDNアーゼと、 10。
ここでは、代替チミジンアナログ5エチニル-2'-デオキシウリジン(EDU)は、ショウジョウバエの大人の卵巣で複製ミトコンドリアDNAを標識するために使用されます。この方法は、より速く、より高感度です。 EDUを容易にDNA複製の間に細胞のDNAに組み込まれます。以下の検出を「クリック」反応に基づいており、銅(I)は、末端アルキン基と蛍光アジド10との間の共有結合反応を触媒による。反応は、試料の変性を必要としないので、それは良好な構造保存を可能にします。色素Aのさらに、サイズzideは1/500ホールマウント組織の迅速かつ効率的な浸透を可能にする抗体分子10のそれのです。私たちは、 ショウジョウバエの卵形成時にミトコンドリアDNAの複製を検出するために、このメソッドを使用し、複製依存ミトコンドリアDNAの選択的継承機構を提案する私たちを導くショウジョウバエ卵巣 11、の胚腺領域での印象的な空間パターンを発見しました。ここでは、ショウジョウバエの卵巣におけるミトコンドリアDNA複製のEDUのラベリングに関する詳細なプロトコルを提示します。 11、ならびにミトコンドリア膜電位を放散し、潜在的にミトコンドリアDNAの複製を妨害するミトコンドリア脱共役剤の多様な治療で:プロトコルの適用を実証するために、我々はまた、ミトコンドリアDNAの変異体ショウジョウバエ (COI T300I MT)でのmtDNAの複製をテストしました。
EDUの標識が新たに合成されたDNAへの組み込みおよびヌクレオシド類縁体の染色に基づいて増殖している細胞においてDNA合成を検出するための新規かつ効率的な方法です。この方法は、迅速かつ高感度であることをBrdU標識方法よりも優れています。さらに重要なのは、それが良好な構造保全とホールマウント組織9、10の効率的なEDU-染料浸透を可能にします。歴史的には、BrdU標識に優れた代替手段として、EDUのラベリングは、のS期の間に核DNAの複製を研究するために使用しました細胞周期。アフィジコリンは、S期における核DNAの複製のための主要なポリメラーゼ12 15であるDNAポリメラーゼαの阻害剤です。ミトコンドリアDNAの複製は、治療をアフィジコリンの影響を受けないDNAポリメラーゼγによって行われます。したがって、前とエドゥのインキュベーション中アフィジコリンによる治療は大幅に核DNAにEDUの取り込みを阻害しました。そうすべきアフィジコリンが適切に保存されている場合は、数週間安定であってもよく、核DNAの複製を阻害するのにアフィジコリンの有効性は、私たちの手で変動したことが注目されます。強い核DNA標識とovariolesまたは卵室は、データ分析から除外されるべきです。
ミトコンドリアDNAの複製が容易に細胞質の総体積に正規化されたEDUの涙点の数を、カウントすることにより、ミトコンドリアDNA複製のレベルを定量化するための簡単な方法を提供する細胞質に斑点として可視化することができます。イメージングソフトウェアは自動的に大きなデータセットの計算分析に特に有用である顕微鏡画像でEDUの涙点を特定するために適用することができます。核DNA複製の不完全な阻害は、染色体上の異なる遺伝子座におけるEDUの取り込みにつながり、核内部の斑点として表示することができますので、しかし、注意事項は、注意が必要です。また、他の例では、EDUの強度はREPLIに組み込みます背景とノイズが高くなる可能性がながらcatingのmtDNAは、弱いかもしれません。そのため、自動画像解析のための個々のパラメータは、慎重に定義する必要があります。また、画像は適切なEDUの斑点が識別されていることを確認するために、専門家の目で検証されなければならないことをお勧めします。
ショウジョウバエの卵形成の間に新たに合成されたミトコンドリアDNAの可視化は、ミトコンドリアDNAの複製が、薬理学的または遺伝的摂動の多様にさらさハエで実験を行うことにより、生理学的または病理学的条件の下で規制されているかを調査する機会を提供します。 COI T300I 11:以前の研究では、EDUの取り込みアッセイは、ミトコンドリアDNAの変異体ショウジョウバエのmtで行いました。また、ミトコンドリア膜電位を破壊するために、卵巣は、ミトコンドリアの脱共役剤FCCP又は2,4-ジニトロフェノール(DNP)前EDUの取り込みの種々の濃度で処理しました。実験の目的に応じておよび薬物の特性、異なる方法が効果的な送達のために採用される可能性があります。成体ハエのために、薬物は、蒸気(例えば、エタノール、コカイン)として提示することができる16,17または薬物は、それがすぐに本体18全体に拡散腹部に注入することができます。最も一般的な方法は、薬物は、フライ食品またはスクロース/薬物飽和濾紙に追加されることです。例えば、微小管集合の阻害剤、コルヒチンは、卵巣解剖19の前に2~3日間ハエに供給しました。したがって、薬物送達方法を評価し、適切な濃度を選択することが重要です。
ショウジョウバエ卵巣におけるミトコンドリアDNA複製の成功イメージングを確保するために、いくつかの重要なステップは、慎重に実行する必要があります。まず、解剖とEDUの取り込み中に卵巣の生存能力と健康を維持することが不可欠である(ステップ1及び2)。 FBSとシュナイダーのショウジョウバエ培地を室温に温めする必要があります使用前に。一つは卵室と解剖ツールやピペットチップとの間の直接的な接触を最小限に抑える必要があります。卵巣は脱水を避けるために、ソリューションの下にすべての回浸漬する必要があります。組織を誤操作することは容易に蛍光シグナルを失神またはNOにつながることはできません。組織実装工程時に、ovariolesが互いに分離されるべきであり、顕微鏡スライド上に広げ。卵室は、互いの上に積み重ねられていないことを確認します。私たちは、ステージ14を越えて卵室は少しEDUの取り込みを表示していることに気づきました。また、ためにサイズが大きい、後期卵室は、多くの場合、隣接若い卵室の焦点が合ってにさせます。したがって、後期卵室が破棄されることをお勧めします。
ここでは、 ショウジョウバエの大人の卵巣でのmtDNAの複製を標識するための詳細なプロトコルを提供します。この方法は、様々な遺伝的および薬理学的摂動下でのmtDNAの複製の簡単な定量を可能にします、および発生ミトコンドリア生合成およびミトコンドリアDNAの継承のメカニズムを解剖するために有用であろう。
The authors have nothing to disclose.
We thank K. Delaney for comments on the manuscript. This work was supported by the National, Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Intramural Program.
Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 21720-024 | |
FBS | Invitrogen | 10100-147 | |
Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Aphidicolin | Sigma | A0781 | Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving. |
FCCP | Sigma | C2920 | |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Paraformaldehyde, 16% EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection. |
PBS | KD Medical | RGF-3190 | |
BSA | Sigma | A7030 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included |
Mouse ATP synthase subunit α antibody, (15H4C4) | MitoSciences | Ab14748 | 1:1000 dilution |
Mouse Hts antibody (clone RC) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | hts RC | 1:1000 dilution |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody | Invitrogen | A-11004 | 1:200 dilution |
Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
Microscope slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
Nail polish | Elf | Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used. |