Ploidy Manipulation von Zebrafischembryonen mit Heat Shock 2 Behandlung

Dieses Protokoll ermöglicht die Manipulation von Ploidie in Zebrabärbling – Embryonen, beispielsweise bei der Erzeugung von homozygoten gynogenetischen Diploiden von gynogenetischen Haploiden (Abbildung 1) oder die Herstellung von tetraploiden. Dies wird durch Induzieren einer Verzögerung in Zytokinese erreicht genau einem Zellenzyklus entspricht (2A, 2B). Der Schlüssel von einem Zyklus Verzögerung in cytokinesis wird durch Behandlung mit Hitzeschock erreicht. Das Standardprotokoll von Hitzeschock (HS) , wie ursprünglich von Streisinger und Kollegen beteiligt einen Temperaturimpuls während des Zeitraums 13-15 MPF, was zu einer Ein-Zyklus der Zellteilung Strömungsabriß während des ersten Zellzyklus – ^1. Die Effizienz dieses Protokolls wurde durch Scannen der frühen Zellzyklen mit einem gleitenden Zeitfenster von Hitzeschockbehandlung vor kurzem verbessert. Dieser Scan einen späteren Zeitpunkt für einen Wärmeschock, noch innerhalb des ersten Zellzyklus (22-24 MPF), die zu einer höheren Rate von embr identifiziertenYos mit einem Zellteilungsströmungsabriß one-Zyklus, der in diesem Fall ² mit der zweiten Zellzyklus wirkt. Die Beobachtung , dass experimentelle Manipulationen während des ersten Zyklus Zelle mit der Zellteilung in der zweiten Zellzyklus stören und DNA – Gehalt Vervielfältigung verursachen wurde auch bei anderen Fischarten ^3,4 berichtet worden. Wir bezeichnen diese modifizierten Protokoll als Heat Shock 2 (HS2 – der Begriff "2" anzeigt, dass der Wärmeimpuls zu einem späteren Zeitpunkt erfolgt als die Standard HS-Methode, und dass der Zellzyklus-Verzögerung durch HS2 tritt während der zweiten Zellzyklus ). Diese Studien zeigten, dass die Grundlage für die Cytokinese Verhaftung nach Hitzeschock ist die Hemmung der centriole Duplizierung während des Wärmeimpulses, der Spindelbildung und Furche Induktions in der folgenden Zellzyklus wirkt. HS2 Ergebnisse in Ausbeuten von Arrest des Zellzyklus 100% nähert, und die Sätze der Ploidie Vervielfältigung bis zu 4 – mal höher als Standard HS ^2.

Die Embryonen behandelt Witzha Hitzeschock während Blastomere Zellzyklus viele schädliche Wirkungen zeigen, was darauf hindeutet , dass die Hitzeschock wirkt sich für die Zellteilung ² mehrere Prozesse erforderlich. Auf der anderen Seite, wenn die Hitzeschock vor der Einleitung des Zellzyklus (Zeitraum 0-30 MPF) angewendet wird, scheint es , Auswirkungen im Einklang mit spezifischen Störungen centriole Doppelarbeit zu haben und scheint nicht andere wesentliche Zellprozesse ² zu beeinflussen . Diese Studien zeigten, dass die Zeit vor dem Beginn der Blastomere Teilung wird eine Entwicklungsperiode zugänglich Verwendung Heat Shock als Werkzeug zu sein, um spezifisch Ploidie durch centriole Hemmung manipulieren. Die zugrunde liegende Ursache der scheinbaren Selektivität für Hitzeschock auf centriole Vervielfältigung ist nicht bekannt, kann aber auf einen selektiven Abbau von Zentrosomen Substrukturen beobachtet unter Hitzestress in bestimmten Zelltypen, wie beispielsweise Leukozyten ⁵ bezogen werden.

Die zeitliche Synchronisation der embryonalen dewicklung wird durch In-vitro-Fertilisation (IVF) erreicht. Verwendung von unbehandeltem Sperma bei der Befruchtung führt zu diploiden Embryonen, die auf einem Zyklus cytokinesis Stall werden tetraploiden HS2-induziert. Die Verwendung von UV-behandelten Spermien, die Vernetzungen trägt, die ihre DNA zu inaktivieren, die Ergebnisse in gynogenetischen haploiden Embryonen ^6, die auf einem Zyklus cytokinesis Stall gynogenetischen diploiden ² werden-HSII induziert. Aufgrund der daraus resultierenden ganze Genomduplikation sind die letzteren gynogenetischen diploiden über das Genom in jedem einzelnen Locus homozygot. Für Prägnanz verweisen wir haploiden Embryonen als "Haploiden", und homozygote gynogenetischen diploiden Embryonen als "homozygot diploiden" zu gynogenetischen. Wenn lebensfähige und fruchtbare können homozygot diploiden verwendet werden steril und tödlich freien Linien zu initiieren. Direkte homozygosity induziert durch HS2 sollte auch leicht in die genetische Analyse oder genetischen Screens eingebaut werden, da homozygot diploiden von Weibchen, die heterozygote Träger von mut sindtionen zeigen Raten von Homozygotie bei hohen und festen (50%) -Verhältnisse ^2.

Das folgende Protokoll beschreibt Schritte HS2 auszuführen und Ploidie Vervielfältigung mit voller homozygosity induzieren. Für tetraploiden Produktion sollte Spermien Lösung unbehandelt sein. Für homozygote diploiden Produktion, Sperma sollte durch UV-Behandlung inaktiviert werden. Darüber hinaus können auch Identifizierung von homozygoten diploiden verwendet werden, wie in der Diskussion, sichtbaren Pigmentmarkern beschrieben zu erleichtern. Zebrabärbling Kumpel in erster Linie während der ersten 3 Stunden nach Einleitung ihrer Licht – Zyklus ⁷ und Erwachsene und Eier sind empfindlich auf zirkadianen Rhythmen ^8, so dass für die besten Ergebnisse der IVF – Verfahren innerhalb dieser Frist erfolgen soll.