Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Eine Einschränkung der derzeitigen HIV-1-Behandlungen ist, dass sie chronisch Fortschreiten der Krankheit zu verhindern, verabreicht werden müssen. Transplantation von HIV-1 resistent T – Lymphozyten oder hämatopoetischen Stammzellen, hat das Potenzial , Langzeitkontrolle der HIV-1 – Replikation in Abwesenheit von Arzneimitteltherapie ^1,2 und kann auch ein wirksamer Ansatz sein , um eine HIV-1 Heilung zu erreichen ^3. Ein Weg , um Zellen resistent gegen HIV-1 – Replikation rendern ist ein oder mehrere Gene einzuführen , kodierend für anti-HIV-1 RNAs oder Peptide in einem infizierten Individuum Zellen während einer autologe Transplantation ^4. Mehrere Kandidaten anti-HIV-1 – Gene wurden mit einigen klinischen Studien Eingabe in Kombinationen von zwei oder drei ^{5 6,} die die Entwicklung von HIV-1 Resistenz gegenüber einem einzelnen Gen zu verhindern.

Anti-HIV-1 RNAs sind unter den ersten Kandidaten für die Kombination Gentherapie aufgrund ihrer niedrigen Potential Immunantworten hervorzurufen, und weil siesind von sehr kurzen Gensequenzen transkribiert. Einige anti-HIV-1 RNAs wurden entwickelt Viruseintritt und Integration zu zielen. Allerdings sind die meisten anti-HIV-1 – RNA das Ziel nach der Integrationsschritte im viralen Lebenszyklus (Abbildung 1). Nachintegration Inhibitoren umfassen Decoy RNAs, die Targeting – HIV-1 – regulatorischen Proteine ​​Tat oder Rev ¹ und Antisense-RNAs beruhen, verschiedene Standorte in HIV-1 – RNA – Targeting, wie Ribozyme ^{7, 8} und shRNAs U1i RNAs ^9. Verfahren, die die Wirksamkeit von Anti-HIV-1 RNAs gehören die Überwachung der viralen Replikation in Zellen , transduziert mit Genen , kodierend für Kandidaten RNAs und Mess virale Produktion in Zellen , transient transfiziert mit Plasmiden exprimieren Kandidaten RNAs und eine HIV-1 – Expressionsplasmid ¹⁰ zum Vergleich verwendet wurden ^-13. Wir haben zuvor eine HIV-1 – Produktion zu screenen Assay HIV-1 RNA für neue Ribozym – Zielstellen ^13-15 verwendet. Diese Verfahren sind seit verfeinert das Format einer RNA zu optimieren,Interferenz – Molekül von dem Plasmid DNA als shRNA oder geliefert als synthetisches siRNA ¹⁶ ausgedrückt. Der Assay misst die Produktion von reifen Viren aus menschlichen embryonalen Nieren (HEK) , 293T – Zellen, und kann verwendet werden , die Auswirkungen von Inhibitoren zu vergleichen , die nach der Integrationsschritte in der HIV-1 – Replikationszyklus Ziel (Abbildung 1). Für Inhibitoren , die Pre-Integrationsschritte Ziel, alternative Assays wie eine TZM-bl Zelle Infektiosität Assay ¹⁷ nötig sind , um antivirale Wirksamkeit zu bewerten.

Wichtige Sicherheitsbedenken für die Lieferung von Anti-HIV-1-RNA in der Klinik sind potenzielle Nebeneffekte auf die menschliche RNAs oder Proteine, und die Aktivierung der angeborenen Immunsensoren. Um die Toxizität von anti-HIV-1 siRNAs bewerten, haben wir einen Zelllebensfähigkeitstest in verschiedenen Zelllinien ¹⁶ verwendet. Wir maßen auch die Aktivierung der doppelsträngigen RNA-Immunsensoren, RNA aktivierte Proteinkinase R (PKR) und Toll-like-Rezeptor 3 (TLR3), sowie expression des Interferon-stimulierte Gen, ADAR1 p150. Diese Assays können verwendet werden, um zu bestätigen, dass die Wirksamkeit von Anti-HIV-1-RNA ist nicht auf indirekte Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen oder Immunsensoraktivierung. Sie sind auch nützlich in Ausnahme von Kandidaten RNAs mit potentiellen Toxizitäten von der weiteren Entwicklung.

In den folgenden Protokolle, Verfahren neue therapeutische RNAs zu identifizieren und zu optimieren das Format der bestehenden beschrieben werden. Die Verfahren sind nützlich für das Screening RNA basieren Nachintegration Inhibitoren der HIV-1 – Replikation und angepasst werden könnten andere post-Integration – Inhibitoren, wie kleine Moleküle Targeting Rev vermittelte Export von viraler RNA ¹⁸ oder CRISPR / CAS – Systeme entwickelt , um screenen integrierten Ziel HIV-1 DNA ^19.