Chemostat를 사용하여 미생물의 적응 연구소 발전을위한 절차
Summary
여기서는 chemostat 문화 사용 조건 하에서 미생물 적응 진화 실험을 얻을 프로토콜을 제시한다. 또한, 진화 된 균주의 게놈 분석은 설명한다.
Abstract
Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism’s genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.
Introduction
미생물이 생존하고 다양한 환경에 적응할 수 있습니다. 심한 스트레스, 적응은 임의의 게놈 변이 이후 긍정적 인 선택 1-3으로 도움이 표현형의 인수를 통해 발생할 수 있습니다. 따라서, 균체는 "적응 진화"이라한다 최적 성장을 위해 대사 또는 규제 네트워크를 변경하여 적용 할 수있다. 이러한 슈퍼 박테리아의 발생 및 강력한 미생물 균주의 발생으로 최근 중요한 미생물 경향은 매우 밀접하게 스트레스 조건에서 진화를 적응 적 관련이 있습니다. 정의 실험실 조건에서, 우리는 분자 진화의 메커니즘을 연구에도 다양한 용도 미생물 진화의 방향을 제어 할 수있다. 그들은 큰 개체군을 유지 빠르게 재생하고, 생성 및 혼을 유지하기 쉽다 : 다세포 유기체 달리 단세포 유기체 이유는 다음 실험실 적응 진화 (ALE)에 적합ogeneous 환경. DNA 시퀀싱 기술과 높은 처리량 기술의 최근 발전과 결합, ALE는 전신 규제 변화로 이어질 게놈의 변화를 직접 관찰 할 수 있습니다. 돌연변이 역학 및 인구의 다양성도 관찰 할 수 있습니다. 유전 공학 전략 ALE 균주 4,5의 분석으로부터 결정될 수있다.
Chemostat 배양 정상 세포를 얻는 발효 공정 6의 생산성을 향상하기 위해 사용하는 방법이다. 신선한 배지를 첨가하고, 배양액의 처리 (후자는 중간 및 바이오 매스를 포함한다) 중에 수확된다. 장기 배양 chemostat 그러나 배양 정상 생산성을 변경하여 배양 (도 1a) 중 자발적인 돌연변이 및 선택의 축적을 초래한다. 다양한 선택 압력 (스트레스)에서 돌연변이의 축적이 향상된다. 장기 응력 점진적 증가 chemostat는 반복 액체 매질에서 고체 배지 및 시리얼 전송 (에서 온도, pH, 삼투압, 영양 결핍, 산화, 독성 최종 제품 등 식민지 전송으로 지정된 스트레스에 반대 돌연변이의 연속 선택을 제공합니다 배치 배양)도 연구 진화 미생물 (도 1B 및 1C)을 수득 할 수있다. chemostat 배양 복잡한 방법이 필요하지만, 다이버 시티 풀 (복제 인구 크기의 수) 콜로니 전송과 시리얼 전송 기술에 의해 얻어진 것보다 높다. 각각의 세포에 안정 스트레스 노출과는 chemostat 문화 (정상 상태) 일괄 문화 기반 기술에 비해 ALE의 다른 혜택입니다 동안 세포 상태의 변화를 감소. 높은 숙시 네이트 조건에 적용 대장균의 스트레스 유발 ALE는이 문서에서 소개된다.
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그림 1 : 적응 형 실험실 진화의 방법 (A) Chemostat;. (B) 시리얼 전송하는 단계; (C) 식민지 전송. 상단 그림은 ALE에 대한 방법의 개념을 설명하고, 아래 그림은 ALE 동안 성장 세포의 수를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
미생물 때문에 빠른 성장 속도와 유전 적 다양성의 거의 모든 환경에 적응시킬 수있다. 적응 진화 실험은 주어진 조건 하에서 유용 자연 돌연변이를 보유하는 개개의 유기체를 선택하는 방법을 제공하는 설계 조건 하에서 미생물 발전을 가능하게한다.
chemostat 기술은 다음과 같은 이유로 이전 기법보다 인위적 구동 발전을 달성하기위한 더 강력 : (a) 정상 환경 – 전송 기술들?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).
Materials
| Mini-chemostat fermentor | Biotron Inc. | – | manufactured by special order |
| silicon tubing | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar. |
| reservoir jar | Bellco | Media storage bottle | 20 L |
| chemicals | Sigma-Aldrich | – | reagent grade |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reagent |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | ACS reagent, ≥99% |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS reagent, ≥99% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS reagent, ≥98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS reagent, ≥96% |
| thiamine·HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | reagent grade, ≥99% |
| Na2·succinate·6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥99% |
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