עיצוב ושימוש בעלות נמוכה, אוטומטי Morbidostat עבור Adaptive אבולוציה מהירה של חיידקים תחת אנטיביוטי והתרופות בחירה
Summary
We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.
Abstract
אנו מתארים בעלות נמוכה, morbidostat להגדרה לאפיון נתיב אבולוציוני של עמידות לאנטיביוטיקה. Morbidostat הוא מכשיר תרבית חיידקים מנטרים התפתחות חיידקים ברציפות ומתאימה באופן דינמי את ריכוז התרופה לקרוא תיגר על חיידקי זמן כפי שהם מתפתחים לרכוש עמידות לתרופות. המכשיר כולל נפח עבודה של ~ 10 מיליליטר הוא אוטומטי לחלוטין ומצויד מדידת צפיפות אופטית ו-משאבות מייקרו בינוני משלוח סמים. כדי לאמת את הפלטפורמה, מדדנו את הרכישה בשלבים של התנגדות trimethoprim ב coli Escherichia MG 1655, ומשולב המכשיר עם פלטפורמת microfluidic מרובבת לחקור מורפולוגיה תאי רגישות לאנטיביוטיקה. הגישה יכול להיות עד-לשנותם כדי במחקרי מעבדה של עמידות לתרופות אנטיביוטיות, והוא extendible כדי אדפטיבית האבולוציה לשיפורים זן בהנדסה מטבולית וניסויים התרבות חיידקים אחרים.
Introduction
מאז כניסתה של פניצילין התרופה הראשון האנטיביוטי, עמידות לאנטיביוטיקה של חיידקים התפתחה עולמית בעיה בריאותית 1. למרות רכישת עמידות לאנטיביוטיקה ניתן ללמוד למפרע in vivo, התנאים של ניסויים אלה הם בדרך כלל לא מבוקרים לאורך האבולוציה כולה 2. לחלופין, אבולוצית מעבדת אדפטיבית יכולה לחשוף את האבולוציה המולקולרית של מינים של חיידקים תחת לחצים סביבתיים או לחץ ברירה מתרופת אנטיביוטיקת 3. לאחרונה, מבוקר היטב ניסויים רבים האבולוציונית של עמידות לתרופות אנטיביוטיות יש הבהיר את הופעתה של עמידות לתרופות אנטיביוטיות. לדוגמה, קבוצה של אוסטין הפגינו הופעתם המהירה בסביבה 4 מחולקים microfluidic מהונדסים כראוי. Morbidostat שפותח לאחרונה גורם מוטציות שיטתיות תחת לחץ ברירת תרופת 5,6. Morbidostat, תמיכה בבחירה מיקרוביאלימכשיר tion אשר מתאים את ריכוז האנטיביוטיקה ללא הרף כדי לשמור על אוכלוסייה קבועה כמעט, הוא התקדמות גדולה ממבחן התנודות בשימוש במיקרוביולוגיה 7,8. במבחן התנודות, תרופה אנטיביוטית מוזרקת בריכוז גבוה, ואת מוטנטים לשרוד מוקרנים ומנה. במקום זאת, חיידקים בתוך morbidostat מאותגרים כל הזמן צוברים מוטציות מרובות.
Morbidostat פועלת בדומה chemostat, מכשיר התרבות הומצא על ידי נוביק ו Szliard בשנת 1950, אשר שומר אוכלוסייה קבועה על ידי אספקת חומרים מזינים באופן רציף תוך דילול אוכלוסיית החיידקים 9. מאז השקתו, את chemostat כבר מתקדמת ומשופרת. chemostats microfluidic הנוכחי הגיע nanoliter וקיבולות תא בודד. עם זאת, מכשירים אלה אינם מתאימים לניסויי אבולוציה אדפטיבית, הדורשים אוכלוסיית תא גדולה עם אירועים רבים מוטציה 10,11. לאחרונה, מיניchemostats עם כרכים עובדים של ~ 10 מיליליטר גם פותח כדי למלא את הפער בין מתקני גידול בהיקף ליטר ואת 12,13 microfluidic chemostat.
כאן אנו מציגים את העיצוב ושימוש של בעלות נמוכה, morbidostat אוטומטית מחקר עמידות לתרופות אנטיביוטי. המודול המוצע יכול להיות מועסק בתוך חממה שייקר במעבדה למיקרוביולוגיה עם דרישת חומרה מינימאלית. הקושחה הקוד הפתוח גם מותאם בקלות ליישומים ספציפיים של התפתחות אדפטיבית, כגון הנדסה מטבולית 3. לבסוף, morbidostat משתלבת פלטפורמת microfluidic מרובבת עבור בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
מכשיר morbidostat נמוך טביעת רגל מרכיבים בעלות הנמוכה מודגם. העליות רמות עמידות לתרופות שנרשמו על ידי המכשיר הנן עקביות עם אלו של דוחות קודמים 5. עוצב עבור מחקרים אבולוציוניים של עמידות לתרופות, המכשיר הוא ישים פוטנציאל ניסויים רבים אחרים. ראשית, מסד נתונים מקיף של מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Prof. Sze-Bi Hsu and Ms. Zhenzhen for useful discussions and help in the theoretical analysis and numerical simulation. Y. T. Y. would like to acknowledge funding support from the Ministry of Science and Technology under grant numbers MOST 103-2220-E-007-026 and MOST 104-2220-E-007-011, and from the National Tsing Hua University under grant numbers 103N2042E1, 104N2042E1, and 105N518CE1.
Materials
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5V supply voltage and 80mA available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure >3kPa Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4mm | |
| Glass scintillation 20ml vial | DGS | Pyrex glass 28mm(dia.)x 61 mm(h) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use X40 objective NA=0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs Max. Pressure 80 Psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500mA, 40V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10kOhm, carbon film resistor, 0.25W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10uF, 25V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
References
- Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
- Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451 (2007).
- Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution – principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64 (2013).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
- Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
- Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
- Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
- Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
- Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
- Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
- Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
- Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262 (2013).
- Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
- Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. . Nat. Protocols. 9, 1713 (2014).
- Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126 (2015).
- Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. . Digital image using Matlab processing. , (2004).
- Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
- Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
- Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
- Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
- Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
- Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267 (2014).
- Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
- Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
- Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).
