Summary

Selezione del flusso e sequenza di Exome delle cellule Reed-Sternberg del linfoma classico di Hodgkin

Published: June 10, 2017
doi:

Summary

Qui descriviamo un sistema di classificazione delle celle citometriche a flusso combinato e un protocollo di costruzione della libreria di nuova generazione, progettato per produrre dati di alta qualità e di esito intero dalle cellule Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) del linfoma classico Hodgkin (CHL).

Abstract

Le cellule Hodgkin Reed-Sternberg del linfoma classico di Hodgkin sono distribuite scarsamente in uno sfondo di linfociti infiammatorie e tipicamente contengono meno dell'1% della massa tumorale. Il materiale derivato da tumore sfuso contiene il contenuto di tumore ad una concentrazione insufficiente per la caratterizzazione. Pertanto, la classificazione delle cellule attivata con fluorescenza usando otto anticorpi, così come spostamento laterale e in avanti, è descritta qui come un metodo di separazione rapida e concentrazione con migliaia di cellule HRS di alta purezza del tumore per il successivo studio. Allo stesso tempo, poiché i protocolli standard per il sequenziamento di exome richiedono tipicamente 100-1.000 ng di DNA in ingresso, spesso troppo elevato, anche con l'ordinamento dei flussi, forniamo anche un protocollo di costruzione della biblioteca ottimizzato e basso in grado di produrre una qualità Dati da appena 10 ng di DNA in ingresso. Questa combinazione è in grado di produrre librerie di nuova generazione adatte alla cattura di ibridazione di interi eXome baits o pannelli mirati più mirati, come desiderato. La sequenza di Exome delle cellule HRS, se confrontata con le cellule T o B intratecorali, può identificare alterazioni somatiche, comprese le mutazioni, le inserzioni e le delezioni e le alterazioni del numero di copie. Questi risultati illustrano la biologia molecolare delle cellule HRS e possono rivelare vie per trattamenti farmacologici mirati.

Introduction

Gli avanzamenti nella genomica del cancro a seguito della sequenza di prossima generazione hanno portato a significativi progressi nell'identificazione di bersagli terapeutici e nella prognosticazione di molte neoplasie ematologiche e non ematologiche. Nuove strategie di trattamento individualizzate basate su alterazioni genomiche specifiche vengono rapidamente introdotte in molti tipi di tumori (esaminati nei riferimenti 1 , 2 ). Nonostante un notevole progresso nella genomica del linfoma, il genoma delle cellule HRS neoplastiche nel linfoma classico di Hodgkin (CHL) era stato indebolito. Le indagini sono state ostacolate dalla scarsità di cellule HRS neoplastiche all'interno di un microambiente reattivo, rendendo difficile l'isolamento delle popolazioni cellulari HRS purificate 3 .

Il metodo per isolare cellule HRS vitali da tumori primari è stato sviluppato da Fromm et al. 4 ,Ref "> 5 , 6. Il metodo utilizza un cocktail di otto anticorpi, composto da CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 e CD64, per identificare in modo inequivocabile le cellule HRS da una sospensione tumorale CHL. Sono in grado di isolare almeno 1000 cellule HRS vitali dalle sospensioni cellulari fresche o congelate da biopsie tumorali costituite da almeno 10 cellule (circa 10 mg di tessuto). La purezza è superiore al 90% mediante analisi citometrica a flusso e si stima che sia Almeno 80% da analisi genomica exome di dieci casi consecutivi.

Abbiamo raffinato una tecnica di isolamento delle cellule citometriche di flusso che ha notevolmente facilitato il processo, consentendo il rapido isolamento di migliaia di cellule HRS vitali da tumori primari CHL 7 . Abbiamo utilizzato la tecnica per produrre quello che si crede essere la prima sequenza di esomeri intero delle cellule tumorali nei casi primari del linfoma di Hodgkin. I nostri studi dimostrano thLa fattibilità di studi di elevata produttività e genoma su singoli casi di CHL e hanno già portato all'identificazione di nuove alterazioni genomiche con il potenziale per spiegare aspetti della patogenesi CHL.

Abbiamo ulteriormente sviluppato una pipeline per utilizzare il DNA estratto per studi genomici ad alto rendimento. Al fine di ottenere risultati affidabili da ben 1000 cellule HRS ordinate (il minimo ottenuto da casi sequenziali), abbiamo ulteriormente sviluppato una procedura di costruzione della libreria di DNA di nuova generazione 8 che ci ha permesso di aumentare l'efficienza della legatura dell'adattatore e di generare librerie di frammenti di DNA Senza amplificazione eccessiva. Questo metodo consente l'analisi di campioni clinici di routine e la rilevazione di mutazioni ricorrenti e alterazioni cromosomiche 7 .

Protocol

1. Tissue Processing e Congelamento Raccogliere il tessuto dei linfonodi in soluzione salina fosfatica (PBS) o Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e procedere entro 24 ore dalla raccolta. Trasferire il tessuto linfonodale ecceduto 9 in un piatto di Petri contenente 10 mL di RPMI con il siero di vitello fetale del 2% (FCS) e finemente tritarlo con una lama di bisturi fresca. Utilizzare il dorso di uno stantuffo da 10 ml per smerigliare / dissociare il tessuto. Trasferire il…

Representative Results

Una trama di bioanalizzatore dovrebbe essere presa dopo l'amplificazione della biblioteca e la pulizia del branello 0.8x. Si dovrebbe vedere una distribuzione "di tipo normale" di dimensioni del frammento nell'intervallo desiderato ( Figura 2a ). Le deviazioni da questa forma, come una "spalla" visibile nella curva, indicano la presenza di un artefatto di peso alto o basso. Ad esempio, la Figura 2b <s…

Discussion

Applicazioni future o indicazioni dopo masterizzazione di questa tecnica

Questo lavoro consente di sequenziare exome da campioni contenenti almeno 10 ng di DNA. Nel contesto clinico, questo limite esclude la maggior parte dei campioni di aspirazione a fine ago a causa di materiale insufficiente, ma comprende adeguate biopsie di base e campioni di biopsia excisa. Ciò consentirà l'acquisizione di dati da un insieme più ampio di campioni possibili.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Lo sviluppo di questo metodo di progetto è stato finanziato dal Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio di Weill Cornell Medical College. Riconosciamo il programma triennale di formazione in biologia e medicina computazionale per un finanziamento parziale. Vorremmo ringraziare gli scienziati che hanno condiviso il loro tempo e conoscenza con noi, in particolare Maryke Appel; Dan Burgess; Iwanka Kozarewa; Chad Locklear; E tutti dal Wemel Cornell Medical Center, tra cui Jenny Zhang, Xiaobo (Shawn) Liang, Dong Xu, Wei Zhang, Huimin Shang, Tatiana Batson e Tuo Zhang.

Materials

Petri or Cell Culture Dish (sterile)
RPMI-1640 Media Roswell Park Memorial Institute
Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated)
Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile
RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month)
scalpel with fresh blade
10 ml syringe (no needle)
Cryogenic vials
50 ml conical centrifuge tubes, force
Centrifuge capable of handling 50 ml conical centrifuge tubes and providing 400g
Hepes buffer(1M, cell culture grade)
phosphate buffered saline (PBS)
Pluoronic-F68 Thermo-Fisher 24040-032
DNAase-I Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D4527-10KU store as 5mg/ml in RPMI in -200C
Bovine Serum Albumin (BSA)
Sort Media (PBS+2%BSA+25mM HEPES+ Pluoronic –F68 (1X))
CD64-FITC (22) Beckman Coulter, Miami, FL 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD30-PE (BerH83) BD Biosciences, San Jose, CA 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD5-ECD (BL1a) Beckman Coulter, Miami, FL 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) Ebiosciences, San Diego, CA 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD20-PC7 (B9E9) Beckman Coulter, Miami, FL 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD15-APC (HI98) BD Biosciences, San Jose, CA 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD45 APC-H7 (2D1) BD Biosciences, San Jose, CA Can be substituted with 10 uL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested
CD95-Pacific Blue (DX2) Life Technologies, Grand Island, NY 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD2 (5 μg; clone RPA-2.10) Biolegend, San Diego, CA For optional protocol; Titering is suggested
CD54 (10 μg; clone 84H10) Serotec, Oxford, United Kingdom For optional protocol; Titering is suggested
CD58 (10 μg; clone TS2/9) eBioscience, San Diego, CA For optional protocol; Titering is suggested
LFA-1 (12 μg; clone MHM23) Novus Biologicals, Littleton, CO For optional protocol; Titering is suggested
BD CS&T Beads BD Biosciences, San Jose, CA
BD Accudrop Beads BD Biosciences, San Jose, CA
BC Versa Comp antibody capture beads Beckman Coulter, Miami, FL Compensation Beads
BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers BD Biosciences, San Jose, CA any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient
Wizard Promega A2360
10 mM Tris-Cl buffer NA
Qubit dsDNA HS Assay kit Life Technologies, Carlsbad, CA
S2 Sonicator Covaris, Woburn, MA Alternatives may be substituted
microTUBE Covaris, Woburn, MA
Low-Throughput Library Preparation Kit Kapa Biosystems, Wilmington, MA KK8221
Sybr Green Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9430
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter, Miami, FL
Bioanalyzer Agilent Technologies, Santa Clara, CA
SeqCap EZ Exome v.3.0 Roche Nimblegen 6465684001
HiSeq Illumina
TruSeq-style Universal adapter Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T
TruSeq-style index adapter Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq-style PCR primer 1 Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa AATGATACGGCGACCACCGAGA
TruSeq-style PCR primer 2 Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
Nuclease Free Duplex Buffer Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa
BD FACSDIVA software BD Biosciences, San Jose, CA
BD Falcon Tubes BD Biosciences, San Jose, CA
BD Flow Tubes BD Biosciences, San Jose, CA

References

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Cite This Article
Reichel, J. B., McCormick, J., Fromm, J. R., Elemento, O., Cesarman, E., Roshal, M. Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma. J. Vis. Exp. (124), e54399, doi:10.3791/54399 (2017).

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