शास्त्रीय हॉजकिन लिम्फोमा के रीड-स्टर्नबर्ग कोशिकाओं के प्रवाह-छंटनी और एक्जी सेक्शनिंग
Summary
यहां, हम एक संयुक्त प्रवाह cytometric सेल सॉर्टिंग और कम इनपुट, अगली पीढ़ी के लाइब्रेरी निर्माण प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो शास्त्रीय हॉजकिन लिम्फोमा (सीएलएल) के हॉजकिन रीड-स्टर्नबर्ग (एचआरएस) कोशिकाओं से उच्च-गुणवत्ता वाले, पूरे-एक्सएम डेटा का निर्माण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था।
Abstract
शास्त्रीय हॉजकिन लिम्फोमा की हॉजकिन रीड-स्टर्नबर्ग कोशिकाएं सूजन में लिम्फोसाइटों की पृष्ठभूमि में बहुत ही कम मात्रा में वितरित की जाती हैं और आम तौर पर ट्यूमर द्रव्यमान का 1% से भी कम शामिल होती हैं। बल्क ट्यूमर से प्राप्त सामग्री में लक्षण वर्णन के लिए अपर्याप्त एकाग्रता में ट्यूमर सामग्री होती है। इसलिए, आठ एंटीबॉडी, साथ ही साइड- और फॉरवर्ड-स्कैटर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग, इसे बाद में अध्ययन के लिए ट्यूमर से उच्च शुद्धता हजारों एचआरएस कोशिकाओं के साथ तेजी से अलग और ध्यान केंद्रित करने की एक विधि के रूप में वर्णित है। उसी समय, क्योंकि एक्सएम अनुक्रमण के लिए मानक प्रोटोकॉल को आम तौर पर 100-1000 एनजी इनपुट डीएनए की आवश्यकता होती है, जो अक्सर बहुत अधिक होता है, यहां तक कि प्रवाह सॉर्टिंग के साथ, हम उच्च-गुणवत्ता वाले उत्पादन के लिए सक्षम एक अनुकूलित, कम-इनपुट लाइब्रेरी निर्माण प्रोटोकॉल भी प्रदान करते हैं इनपुट डीएनए के 10 एनजी जितना छोटा डेटा यह संयोजन पूरे-ए के हाइब्रिडिज़ेशन कैप्चर के लिए उपयुक्त अगली पीढ़ी के पुस्तकालयों को बनाने में सक्षम हैXome baits या अधिक केंद्रित लक्षित पैनल, वांछित के रूप में स्वस्थ intratumor टी या बी कोशिकाओं के साथ तुलना में एचआरएस कोशिकाओं की तुलना करना, एग्जाम अनुक्रमण, म्यूटेशन, सम्मिलन और विलोपन सहित नकली परिवर्तनों की पहचान कर सकता है, और कॉपी संख्या में बदलाव। ये शोध एचआरएस कोशिकाओं के आणविक जीव विज्ञान को स्पष्ट करते हैं और लक्षित दवाओं के उपचार के लिए रास्ते प्रकट कर सकते हैं।
Introduction
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के परिणामस्वरूप कैंसर जीनोमिक्स में प्रगति ने चिकित्सीय लक्ष्य की पहचान और कई हेमटोग्लोलिक और गैर हेमेटाल्जिक न्यूप्लाज्म के लिए भविष्यवाणी में महत्वपूर्ण सफलताओं को जन्म दिया है। विशिष्ट जीनोमिक परिवर्तनों के आधार पर नई व्यक्तिगत उपचार रणनीतियों को तेजी से कई ट्यूमर प्रकारों में पेश किया जा रहा है (संदर्भ 1 , 2 में समीक्षा) लिम्फोमा जीनोमिक्स में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद शास्त्रीय हॉजकिन लिंफोमा (सीएचएल) में नवोप्लास्टिक एचआरएस कोशिकाओं के जीनोम को अंडरेक्सप्लार्ड किया गया था। एक प्रतिक्रियाशील microenvironment के भीतर नेपलास्टिक एचआरएस कोशिकाओं की कमी से जांच में बाधा आ गई है, जिससे शुद्ध एचआरएस सेल आबादी 3 को अलग करना मुश्किल हो गया है।
प्राथमिक ट्यूमर से व्यवहार्य एचआरएस कोशिकाओं को अलग करने के लिए विधि फ्रॉम एट अल द्वारा विकसित किया गया था 4 ,सीएफएल ट्यूमर निलंबन से एचआरएस कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से पहचानने के लिए सीडी 30, सीडी 15, सीडी 40, सीडी 5 9, सीडी 45 सीडी 20, सीडी 5, और सीडी 464 से मिलकर इस पद्धति में आठ एंटीबॉडी कॉकटेल का इस्तेमाल होता है। इस पद्धति का उपयोग करके, हम कम से कम 10 7 कोशिकाओं (लगभग 10 मिलीग्राम ऊतक) से युक्त ट्यूमर बायोप्सी से ताजा या फ्रोजन सेल निलंबन से कम से कम 1,000 व्यावहारिक एचआरएस कोशिकाओं को अलग करने में सक्षम हैं। शुद्धता cytometric विश्लेषण द्वारा शुद्धता 90% से अधिक है और इसका अनुमान दस लगातार मामलों के एक्समो जीनोमिक विश्लेषण द्वारा कम से कम 80%
हमने एक प्रवाह साइटेमेट्रिक सेल अलगाव तकनीक को परिष्कृत किया है, जिसने प्रक्रिया को बहुत कम किया है, जिससे प्राथमिक सीएचएल ट्यूमर 7 से हजारों व्यवहार्य मानव संसाधन कोशिकाओं के तेजी से अलगाव की अनुमति मिलती है। हमने हॉजकिन लिंफोमा के प्राथमिक मामलों में ट्यूमर कोशिकाओं के पहले पूर्ण-एक्सएम अनुक्रम के रूप में माना जाने वाला तकनीक तैयार करने के लिए तकनीक का उपयोग किया है। हमारा अध्ययन वें प्रदर्शित करता हैएसएचएल मामलों के व्यक्तियों के उच्च-थ्रूपूट, जीनोम-विस्तृत अध्ययन की व्यवहार्यता और सीएलएल पैथोजेनेसिस के पहलुओं की व्याख्या करने की क्षमता के साथ उपन्यास जीनोमिक परिवर्तन की पहचान करने के लिए पहले ही पैदा हुई है।
हमने उच्च-थ्रुपुट जीनोमिक अध्ययनों के लिए निकाले गए डीएनए का उपयोग करने के लिए एक पाइपलाइन विकसित की है। 1,000 से अधिक सॉर्ट एचआरएस कोशिकाओं (न्यूनतम अनुक्रमिक मामलों से प्राप्त) से विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, हमने आगे संशोधित अगली पीढ़ी के डीएनए पुस्तकालय निर्माण प्रक्रिया 8 विकसित की, जिससे हमें एडेप्टर लैगिंग दक्षता में वृद्धि करने और डीएनए टुकड़ा पुस्तकालयों को बनाने में मदद मिली। अत्यधिक प्रवर्धन के बिना इस पद्धति से नियमित नैदानिक नमूनों के विश्लेषण और आवर्तक उत्परिवर्तन और क्रोमोसोमल परिवर्तन 7 का पता लगाने की अनुमति मिलती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस तकनीक को माहिर होने के बाद भविष्य के अनुप्रयोग या निर्देश
यह काम डीएनए के कम से कम 10 एनजी युक्त नमूनों से एक्सोह अनुक्रमण के लिए अनुमति देता है। नैदानिक संदर्भ में, इस सीमा में अपर?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस प्रोजेक्ट मेथड का विकास, वेइल कॉर्नेल मेडिकल कॉलेज के पैथोलॉजी और प्रयोगशाला चिकित्सा विभाग द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम आंशिक वित्त पोषण के लिए कम्प्यूटेशनल जीवविज्ञान और चिकित्सा में त्रि-संस्थागत प्रशिक्षण कार्यक्रम को स्वीकार करते हैं। हम उन वैज्ञानिकों का धन्यवाद करना चाहते हैं जिन्होंने हमारे साथ अपना समय और ज्ञान साझा किया, विशेषकर मेरीके अप्सेल; दान बर्गेस; Iwanka Kozarewa; चाड लोक्लायर; और जेन झांग, ज़ियाओबो (शॉन) लिआंग, दांग झू, वी झांग, हुइमिन शांग, तातियाना बैटसन और तुओ झांग सहित वेइल कॉर्नेल मेडिकल कॉलेज जीनोमिक्स कोर सुविधा से हर कोई।
Materials
| Petri or Cell Culture Dish (sterile) | |||
| RPMI-1640 Media | Roswell Park Memorial Institute | ||
| Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated) | |||
| Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile | |||
| RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month) | |||
| scalpel with fresh blade | |||
| 10 ml syringe (no needle) | |||
| Cryogenic vials | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes, force | |||
| Centrifuge | capable of handling 50 ml conical centrifuge tubes and providing 400g | ||
| Hepes buffer(1M, cell culture grade) | |||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Pluoronic-F68 | Thermo-Fisher | 24040-032 | |
| DNAase-I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D4527-10KU | store as 5mg/ml in RPMI in -200C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | |||
| Sort Media (PBS+2%BSA+25mM HEPES+ Pluoronic –F68 (1X)) | |||
| CD64-FITC (22) | Beckman Coulter, Miami, FL | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD30-PE (BerH83) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD5-ECD (BL1a) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) | Ebiosciences, San Diego, CA | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD20-PC7 (B9E9) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD15-APC (HI98) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD45 APC-H7 (2D1) | BD Biosciences, San Jose, CA | Can be substituted with 10 uL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested | |
| CD95-Pacific Blue (DX2) | Life Technologies, Grand Island, NY | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD2 (5 μg; clone RPA-2.10) | Biolegend, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD54 (10 μg; clone 84H10) | Serotec, Oxford, United Kingdom | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD58 (10 μg; clone TS2/9) | eBioscience, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| LFA-1 (12 μg; clone MHM23) | Novus Biologicals, Littleton, CO | For optional protocol; Titering is suggested | |
| BD CS&T Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Accudrop Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BC Versa Comp antibody capture beads | Beckman Coulter, Miami, FL | Compensation Beads | |
| BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers | BD Biosciences, San Jose, CA | any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient | |
| Wizard | Promega | A2360 | |
| 10 mM Tris-Cl buffer | NA | ||
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | ||
| S2 Sonicator | Covaris, Woburn, MA | Alternatives may be substituted | |
| microTUBE | Covaris, Woburn, MA | ||
| Low-Throughput Library Preparation Kit | Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK8221 | |
| Sybr Green | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S9430 | |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter, Miami, FL | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| SeqCap EZ Exome v.3.0 | Roche Nimblegen | 6465684001 | |
| HiSeq | Illumina | ||
| TruSeq-style Universal adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T | |
| TruSeq-style index adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG | |
| TruSeq-style PCR primer 1 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | AATGATACGGCGACCACCGAGA | |
| TruSeq-style PCR primer 2 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | CAAGCAGAAGACGGCATACGAG | |
| Nuclease Free Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | ||
| BD FACSDIVA software | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Falcon Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Flow Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
References
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