Summary

Flow-Sortierung und Exome Sequenzierung der Reed-Sternberg-Zellen des klassischen Hodgkin-Lymphoms

Published: June 10, 2017
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Summary

Hier beschreiben wir ein kombiniertes Durchflusszytometrisches Zellsortier- und Low-Input-Bibliothekskonstruktionsprotokoll der nächsten Generation, das für die Herstellung von hochwertigen, exakt exakten Daten aus den Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) Zellen des klassischen Hodgkin-Lymphoms (CHL) entwickelt wurde.

Abstract

Die Hodgkin-Reed-Sternberg-Zellen des klassischen Hodgkin-Lymphoms sind im Hintergrund von entzündlichen Lymphozyten spärlich verteilt und enthalten typischerweise weniger als 1% der Tumormasse. Material, das aus Massen-Tumor gewonnen wird, enthält den Tumorgehalt in einer für die Charakterisierung unzureichenden Konzentration. Daher wird hier die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung mit acht Antikörpern sowie Neben- und Vorwärtsstreuung als Verfahren zur schnellen Trennung und Konzentration von hochreinen Tausenden von HRS-Zellen aus dem Tumor für die anschließende Untersuchung beschrieben. Zur gleichen Zeit, weil Standard-Protokolle für Exome-Sequenzierung in der Regel benötigen 100-1000 ng Eingangs-DNA, die oft zu hoch ist, auch mit Flow-Sortierung, bieten wir auch eine optimierte, Low-Input-Bibliothek Bau-Protokoll in der Lage, qualitativ hochwertige Daten von so wenig wie 10 ng Eingangs-DNA. Diese Kombination ist in der Lage, Bibliotheken der nächsten Generation zu produzieren, die für die Hybridisierung von Ganzkörper e geeignet sindXome Köder oder mehr fokussierte Zielpaneele, wie gewünscht. Exome-Sequenzierung der HRS-Zellen, wenn sie mit gesunden intratumoralen T- oder B-Zellen verglichen werden, können somatische Veränderungen, einschließlich Mutationen, Insertionen und Deletionen, und Kopienzahländerungen identifizieren. Diese Erkenntnisse erläutern die Molekularbiologie von HRS-Zellen und können Wege für gezielte Arzneimittelbehandlungen zeigen.

Introduction

Fortschritte in der Krebsgenomik als Folge der Sequenzierung der nächsten Generation führten zu signifikanten Durchbrüchen bei der Identifizierung von therapeutischen Targets und bei der Prognose für viele hämatologische und nicht-hämatologische Neoplasien. Neue individualisierte Behandlungsstrategien, die auf spezifischen genomischen Veränderungen basieren, werden in vielen Tumortypen schnell eingeführt (in den Referenzen 1 , 2 ). Trotz signifikanter Fortschritte bei der Lymphom-Genomik war das Genom der neoplastischen HRS-Zellen im klassischen Hodgkin-Lymphom (CHL) unerklärt. Die Untersuchungen wurden durch die Knappheit von neoplastischen HRS-Zellen in einer reaktiven Mikroumgebung behindert, was es schwierig macht, gereinigte HRS-Zellpopulationen zu isolieren 3 .

Das Verfahren zur Isolierung lebensfähiger HRS-Zellen aus Primärtumoren wurde von Fromm et al. 4 ,Ref "> 5 , 6. Das Verfahren verwendet einen Acht-Antikörper-Cocktail, bestehend aus CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 und CD64, um HRS-Zellen aus einer CHL-Tumorsuspension eindeutig zu identifizieren Sind in der Lage, mindestens 1000 lebensfähige HRS-Zellen aus frischen oder gefrorenen Zellsuspensionen aus Tumorbiopsien zu isolieren, die aus mindestens 10 7 Zellen bestehen (ca. 10 mg Gewebe). Die Reinheit ist größer als 90% durch Durchflusszytometrieanalyse und wird geschätzt Mindestens 80% durch exome genomische Analyse von zehn aufeinander folgenden Fällen.

Wir haben eine Durchflusszytometrische Zellisolationstechnik verfeinert, die den Prozess stark erleichtert hat, was die schnelle Isolierung von Tausenden von lebensfähigen HRS-Zellen aus primären CHL-Tumoren ermöglicht. Wir haben die Technik verwendet, um zu produzieren, was geglaubt wird, um die erste Voll-Exome-Sequenz der Tumorzellen in primären Fällen von Hodgkin-Lymphom zu sein. Unsere Studien zeigen,E-Durchführbarkeit von hochdurchsatzreichen, genomweiten Studien einzelner CHL-Fälle und haben bereits zur Identifizierung neuartiger genomischer Veränderungen mit dem Potenzial zur Erklärung von Aspekten der CHL-Pathogenese geführt.

Wir haben eine Pipeline weiterentwickelt, um die extrahierte DNA für genetische Untersuchungen mit hohem Durchsatz zu nutzen. Um zuverlässige Ergebnisse von bis zu 1.000 sortierten HRS-Zellen zu erzielen (das Minimum, das aus sequentiellen Fällen erhalten wurde), entwickelten wir ein modifiziertes DNA-Bibliotheks-Konstruktionsverfahren 8 der nächsten Generation, das es uns ermöglichte, die Adapter-Ligationseffizienz zu erhöhen und DNA-Fragment-Bibliotheken zu erzeugen Ohne übermäßige Verstärkung. Diese Methode ermöglicht die Analyse von routinemäßigen klinischen Proben und den Nachweis von wiederkehrenden Mutationen und chromosomalen Veränderungen 7 .

Protocol

1. Gewebeverarbeitung und Einfrieren Sammeln Sie Lymphknotengewebe in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) und verarbeiten Sie innerhalb von 24 Stunden der Sammlung. Das ausgeschnittene Lymphknotengewebe 9 auf eine Petrischale mit 10 ml RPMI mit 2% fötalem Kälberserum (FCS) überführen und mit einer frischen Skalpellklinge fein zerkleinern. Benutzen Sie die Rückseite eines 10-ml-Spritzenkolbens, um das Gewebe weiter zu schleif…

Representative Results

Ein Bioanalyzer-Plot sollte nach der Bibliotheksverstärkung und 0,8x Perlenreinigung aufgenommen werden. Man sollte eine "normalähnliche" Verteilung der Fragmentgrößen im gewünschten Bereich sehen (Abbildung 2a ). Abweichungen von dieser Form, wie eine sichtbare "Schulter" in der Kurve, zeigen die Anwesenheit eines Artefakts mit hohem oder niedrigem Molekulargewicht an. Beispielsweise zeigt Fig. …

Discussion

Zukünftige Anwendungen oder Richtungen nach der Beherrschung dieser Technik

Diese Arbeit ermöglicht die Exome-Sequenzierung aus Proben, die mindestens 10 ng DNA enthalten. Im klinischen Kontext schließt diese Grenze die meisten Feinnadel-Aspirationsproben aufgrund unzureichender Materialien aus, enthält aber adäquate Kernbiopsien und exzisionsbiopsische Proben. Dies ermöglicht die Erfassung von Daten aus einem größeren Satz von möglichen Samples.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Entwicklung dieser Projektmethode wurde von der Abteilung für Pathologie und Labormedizin von Weill Cornell Medical College finanziert. Wir bestätigen das Tri-Institutional Trainingsprogramm in Computational Biology and Medicine zur Teilfinanzierung. Wir danken den Wissenschaftlern, die ihre Zeit und ihr Wissen mit uns teilen, besonders Maryke Appel; Dan Burgess; Iwanka Kozarewa; Tschad Locklear; Und alle von der Weill Cornell Medical College Genomics Core Facility, einschließlich Jenny Zhang, Xiaobo (Shawn) Liang, Dong Xu, Wei Zhang, Huimin Shang, Tatiana Batson und Tuo Zhang.

Materials

Petri or Cell Culture Dish (sterile)
RPMI-1640 Media Roswell Park Memorial Institute
Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated)
Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile
RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month)
scalpel with fresh blade
10 ml syringe (no needle)
Cryogenic vials
50 ml conical centrifuge tubes, force
Centrifuge capable of handling 50 ml conical centrifuge tubes and providing 400g
Hepes buffer(1M, cell culture grade)
phosphate buffered saline (PBS)
Pluoronic-F68 Thermo-Fisher 24040-032
DNAase-I Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D4527-10KU store as 5mg/ml in RPMI in -200C
Bovine Serum Albumin (BSA)
Sort Media (PBS+2%BSA+25mM HEPES+ Pluoronic –F68 (1X))
CD64-FITC (22) Beckman Coulter, Miami, FL 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD30-PE (BerH83) BD Biosciences, San Jose, CA 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD5-ECD (BL1a) Beckman Coulter, Miami, FL 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) Ebiosciences, San Diego, CA 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD20-PC7 (B9E9) Beckman Coulter, Miami, FL 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD15-APC (HI98) BD Biosciences, San Jose, CA 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD45 APC-H7 (2D1) BD Biosciences, San Jose, CA Can be substituted with 10 uL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested
CD95-Pacific Blue (DX2) Life Technologies, Grand Island, NY 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD2 (5 μg; clone RPA-2.10) Biolegend, San Diego, CA For optional protocol; Titering is suggested
CD54 (10 μg; clone 84H10) Serotec, Oxford, United Kingdom For optional protocol; Titering is suggested
CD58 (10 μg; clone TS2/9) eBioscience, San Diego, CA For optional protocol; Titering is suggested
LFA-1 (12 μg; clone MHM23) Novus Biologicals, Littleton, CO For optional protocol; Titering is suggested
BD CS&T Beads BD Biosciences, San Jose, CA
BD Accudrop Beads BD Biosciences, San Jose, CA
BC Versa Comp antibody capture beads Beckman Coulter, Miami, FL Compensation Beads
BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers BD Biosciences, San Jose, CA any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient
Wizard Promega A2360
10 mM Tris-Cl buffer NA
Qubit dsDNA HS Assay kit Life Technologies, Carlsbad, CA
S2 Sonicator Covaris, Woburn, MA Alternatives may be substituted
microTUBE Covaris, Woburn, MA
Low-Throughput Library Preparation Kit Kapa Biosystems, Wilmington, MA KK8221
Sybr Green Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9430
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter, Miami, FL
Bioanalyzer Agilent Technologies, Santa Clara, CA
SeqCap EZ Exome v.3.0 Roche Nimblegen 6465684001
HiSeq Illumina
TruSeq-style Universal adapter Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T
TruSeq-style index adapter Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq-style PCR primer 1 Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa AATGATACGGCGACCACCGAGA
TruSeq-style PCR primer 2 Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
Nuclease Free Duplex Buffer Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa
BD FACSDIVA software BD Biosciences, San Jose, CA
BD Falcon Tubes BD Biosciences, San Jose, CA
BD Flow Tubes BD Biosciences, San Jose, CA

References

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Cite This Article
Reichel, J. B., McCormick, J., Fromm, J. R., Elemento, O., Cesarman, E., Roshal, M. Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma. J. Vis. Exp. (124), e54399, doi:10.3791/54399 (2017).

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