Summary

Flow-sortering en Exome Sequencing van de Reed-Sternberg Cellen van Klassieke Hodgkin Lymfoom

Published: June 10, 2017
doi:

Summary

Hier beschrijven we een gecombineerde flow cytometrische celsortering en een laag ingevoerde, volgende generatie bibliotheekconstructieprotocol dat is ontworpen om hoogwaardige, volledige exome data van de Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) cellen van klassiek Hodgkin lymfoom (CHL) te produceren.

Abstract

De Hodgkin Reed-Sternberg cellen van klassiek Hodgkin lymfoom zijn gering verdeeld binnen een achtergrond van ontstekingslymfocyten en omvatten gewoonlijk minder dan 1% van de tumormassa. Materiaal afgeleid van bulk tumor bevat tumor inhoud bij een concentratie onvoldoende voor karakterisering. Daarom wordt de fluorescentie geactiveerde celsortering met behulp van acht antilichamen, evenals zij- en voorwaartse verspreiding hier beschreven als een methode om snel met duizend HRS-cellen uit de tumor voor de volgende studie snel te scheiden en te concentreren. Tegelijkertijd, omdat standaardprotocollen voor exome-sequencing meestal 100-1000 ng input-DNA nodig hebben, dat vaak te hoog is, ook bij het sorteren van vloeistoffen, bieden wij ook een geoptimaliseerd, lage invoer bibliotheekconstructieprotocol dat in staat is hoge kwaliteit te produceren Gegevens van zo weinig als 10 ng input DNA. Deze combinatie kan de volgende generatie bibliotheken produceren die geschikt zijn voor hybridisatie-opname van whole-eXome aasjes of meer gerichte gerichte panelen, zoals gewenst. Exome sequencing van de HRS-cellen, in vergelijking met gezonde T-cellen van T-cellen of B, kunnen somatische veranderingen identificeren, waaronder mutaties, invoegingen en deleties, en kopie-nummerveranderingen. Deze bevindingen verduidelijken de moleculaire biologie van HRS-cellen en kunnen routes voor gerichte geneesmiddelen behandelen.

Introduction

Bevorderingen in kankergenetica als gevolg van volgende generatie sequencing hebben geleid tot significante doorbraken bij de identificatie van therapeutische doelen en in prognosticatie voor veel hematologische en niet-hematologische neoplasma's. Nieuwe geïndividualiseerde behandelingsstrategieën op basis van specifieke genomische veranderingen worden snel ingevoerd in veel tumortypes (onderzocht in referenties 1 , 2 ). Ondanks de significante vooruitgang in de lymfoom genomics, was het genoom van de neoplastische HRS-cellen in klassiek Hodgkin lymfoom (CHL) onderzocht. De onderzoeken zijn belemmerd door de schaarste van neoplastische HRS-cellen binnen een reactieve microomgeving, waardoor het moeilijk is om gesuiverde HRS-celpopulaties te isoleren 3 .

De werkwijze voor het isoleren van levensvatbare HRS-cellen uit primaire tumoren werd ontwikkeld door Fromm et al. 4 ,Ref "> 5 , 6. De methode maakt gebruik van een acht-antilichaamcocktail, bestaande uit CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 en CD64 om ondubbelzinnig HRS-cellen te identificeren uit een CHL tumor suspensie. Zijn in staat om ten minste 1000 levensvatbare HRS-cellen te isoleren uit verse of bevroren cel suspensies van tumorbiopsies bestaande uit ten minste 10 7 cellen (ongeveer 10 mg weefsel). De zuiverheid is meer dan 90% door middel van flowcytometrische analyse en wordt geschat op Minstens 80% door middel van exome genomische analyse van tien opeenvolgende gevallen.

We hebben een flow-cytometrische celisolatie techniek verfijnd die het proces aanzienlijk vergemakkelijkt, waardoor een snelle isolatie van duizenden levensvatbare HRS-cellen uit primaire CHL tumoren 7 mogelijk is . We hebben de techniek gebruikt om te produceren wat wordt aangenomen dat het de eerste hele exome sequentie van de tumorcellen is in primaire gevallen van Hodgkin lymfoom. Onze studies tonen aan datE haalbaarheid van high-throughput, genoom-brede studies van individuele CHL-gevallen en hebben al geleid tot de identificatie van nieuwe genomische veranderingen met het potentieel om aspecten van CHL pathogenese uit te leggen.

We hebben verder een pijpleiding ontwikkeld om het geëxtraheerde DNA te gebruiken voor genomische studies met hoge doorvoer. Om betrouwbare resultaten te verkrijgen van zo weinig als 1.000 gesorteerd HRS cellen (het minimum verkregen uit sequentiële gevallen), ontwikkelden we een gewijzigde volgende generatie DNA bibliotheek constructie procedure 8 die ons toestaat om de adapter ligatie efficiëntie te verhogen en DNA fragmenten bibliotheken te genereren Zonder overmatige amplificatie. Deze methode zorgt voor de analyse van routine klinische monsters en de detectie van herhalende mutaties en chromosomale veranderingen 7 .

Protocol

1. Weefselverwerking en bevriezing Verzamel lymfeklierenweefsel in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) en verwerk binnen 24 uur van de verzameling. Breng gesneden lymfeklierweefsel 9 over op een Petri-schotel die 10 ml RPMI bevat met 2% foetaal kalfserum (FCS) en fijnmeel het met een vers scalpelblad. Gebruik de achterkant van een 10 ml injectiespuit om het weefsel verder te slijpen / los te maken. Breng de vloeistof over in …

Representative Results

Een bioanalyzer plot moet worden genomen na bibliotheek amplificatie en 0,8x kraal opruimen. Men zou een "normaal" verspreiding van fragmentgroottes moeten zien in het gewenste bereik ( figuur 2a ). Afwijkingen van deze vorm, zoals een zichtbare "schouder" in de kromme, geven de aanwezigheid aan van een artefact met een hoge of lage molecuulgewicht. Bijvoorbeeld , Figuur 2b -2d</stron…

Discussion

Toekomstige toepassingen of aanwijzingen na het masteren van deze techniek

Dit werk laat exome sequencing toe van monsters die tenminste 10 ng DNA bevatten. In de klinische context sluit deze limiet de meeste fijne aspiratiemonsters weg van onvoldoende materiaal, maar bevat ook adequate kernbiopsies en excisie-biopsiemonsters. Dit zal de aanschaf van gegevens van een grotere reeks mogelijke monsters mogelijk maken.

Kritieke stappen binnen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De ontwikkeling van deze projectmethode is gefinancierd door de afdeling pathologie en laboratoriumgeneeskunde van Weill Cornell Medical College. Wij erkennen het Tri-institutionele Opleidingsprogramma in Computational Biology and Medicine voor gedeeltelijke financiering. Wij danken de wetenschappers die hun tijd en kennis met ons hebben gedeeld, vooral Maryke Appel; Dan Burgess; Iwanka Kozarewa; Chad Locklear; En iedereen van de Weill Cornell Medical College Genomics Core Facility, waaronder Jenny Zhang, Xiaobo (Shawn) Liang, Dong Xu, Wei Zhang, Huimin Shang, Tatiana Batson en Tuo Zhang.

Materials

Petri or Cell Culture Dish (sterile)
RPMI-1640 Media Roswell Park Memorial Institute
Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated)
Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile
RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month)
scalpel with fresh blade
10 ml syringe (no needle)
Cryogenic vials
50 ml conical centrifuge tubes, force
Centrifuge capable of handling 50 ml conical centrifuge tubes and providing 400g
Hepes buffer(1M, cell culture grade)
phosphate buffered saline (PBS)
Pluoronic-F68 Thermo-Fisher 24040-032
DNAase-I Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D4527-10KU store as 5mg/ml in RPMI in -200C
Bovine Serum Albumin (BSA)
Sort Media (PBS+2%BSA+25mM HEPES+ Pluoronic –F68 (1X))
CD64-FITC (22) Beckman Coulter, Miami, FL 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD30-PE (BerH83) BD Biosciences, San Jose, CA 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD5-ECD (BL1a) Beckman Coulter, Miami, FL 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) Ebiosciences, San Diego, CA 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD20-PC7 (B9E9) Beckman Coulter, Miami, FL 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD15-APC (HI98) BD Biosciences, San Jose, CA 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD45 APC-H7 (2D1) BD Biosciences, San Jose, CA Can be substituted with 10 uL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested
CD95-Pacific Blue (DX2) Life Technologies, Grand Island, NY 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD2 (5 μg; clone RPA-2.10) Biolegend, San Diego, CA For optional protocol; Titering is suggested
CD54 (10 μg; clone 84H10) Serotec, Oxford, United Kingdom For optional protocol; Titering is suggested
CD58 (10 μg; clone TS2/9) eBioscience, San Diego, CA For optional protocol; Titering is suggested
LFA-1 (12 μg; clone MHM23) Novus Biologicals, Littleton, CO For optional protocol; Titering is suggested
BD CS&T Beads BD Biosciences, San Jose, CA
BD Accudrop Beads BD Biosciences, San Jose, CA
BC Versa Comp antibody capture beads Beckman Coulter, Miami, FL Compensation Beads
BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers BD Biosciences, San Jose, CA any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient
Wizard Promega A2360
10 mM Tris-Cl buffer NA
Qubit dsDNA HS Assay kit Life Technologies, Carlsbad, CA
S2 Sonicator Covaris, Woburn, MA Alternatives may be substituted
microTUBE Covaris, Woburn, MA
Low-Throughput Library Preparation Kit Kapa Biosystems, Wilmington, MA KK8221
Sybr Green Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9430
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter, Miami, FL
Bioanalyzer Agilent Technologies, Santa Clara, CA
SeqCap EZ Exome v.3.0 Roche Nimblegen 6465684001
HiSeq Illumina
TruSeq-style Universal adapter Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T
TruSeq-style index adapter Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq-style PCR primer 1 Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa AATGATACGGCGACCACCGAGA
TruSeq-style PCR primer 2 Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
Nuclease Free Duplex Buffer Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa
BD FACSDIVA software BD Biosciences, San Jose, CA
BD Falcon Tubes BD Biosciences, San Jose, CA
BD Flow Tubes BD Biosciences, San Jose, CA

References

  1. Abrams, J. National Cancer Institute’s Precision Medicine Initiatives for the new National Clinical Trials Network. American Society of Clinical Oncology educational book / ASCO. American Society of Clinical Oncology. Meeting. , 71-76 (2014).
  2. Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome medicine. 7, 80 (2015).
  3. Matsuki, E., Younes, A. Lymphomagenesis in Hodgkin lymphoma. Seminars in cancer biology. 34, 14-21 (2015).
  4. Fromm, J. R., Kussick, S. J., Wood, B. L. Identification and purification of classical Hodgkin cells from lymph nodes by flow cytometry and flow cytometric cell sorting. Am J Clin Pathol. 126 (5), 764-780 (2006).
  5. Fromm, J. R., Thomas, A., Wood, B. L. Flow cytometry can diagnose classical hodgkin lymphoma in lymph nodes with high sensitivity and specificity. Am J Clin Pathol. 131 (3), 322-332 (2009).
  6. Roshal, M., Wood, B. L., Fromm, J. R. Flow cytometric detection of the classical hodgkin lymphoma: clinical and research applications. Advances in hematology. 2011, 387034 (2011).
  7. Reichel, J., et al. Flow sorting and exome sequencing reveal the oncogenome of primary Hodgkin and Reed-Sternberg cells. Blood. 125 (7), 1061-1072 (2015).
  8. Kozarewa, I. A Modified Method for Whole Exome Resequencing from Minimal Amounts of Starting DNA. PLoS ONE. 7 (3), e32617 (2012).
  9. Brunicardi, F. C. . Schwartz’s Principles of Surgery. , (2014).
  10. Kantor, A. B., Roederer, M. FACS analysis of leukocytes. Handbook of Experimental Immunology. 2, (1996).
  11. Sanders, M. E. Molecular pathways of adhesion in spontaneous rosetting of T-lymphocytes to the Hodgkin’s cell line L428. Cancer Res. 48 (1), 37-40 (1988).
  12. Biosciences. . FACSAria II User’s Guide. Part No. 644832, Revision A. , (2009).
  13. . Qubit 3.0 Fluorometer, Catalog Number Q33216 Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33216 (2017)
  14. Roche Nimblegen. . SeqCap EZ Library SR User’s Guide ver. 4.1. , (2013).
  15. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  16. Li, H. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  17. Saunders, C. T. Strelka: accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
  18. Cingolani, P., et al. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly (Austin). 6 (2), 80-92 (2012).
  19. Dobin, A. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. . DNA copy number data analysis. v.R package version 1.34.0 Available from: https://omictools.com/dnacopy-tool (2013)

Play Video

Cite This Article
Reichel, J. B., McCormick, J., Fromm, J. R., Elemento, O., Cesarman, E., Roshal, M. Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma. J. Vis. Exp. (124), e54399, doi:10.3791/54399 (2017).

View Video