Classificação de fluxo e sequenciação Exome das células de Reed-Sternberg do linfoma de Hodgkin clássico
Summary
Aqui, descrevemos uma classificação de células de citometria de fluxo combinado e um protocolo de construção de bibliotecas de próxima geração, de baixa entrada, projetado para produzir dados de alta qualidade e total de exomas das células Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) do linfoma de Hodgkin clássico (CHL).
Abstract
As células de Hodgkin Reed-Sternberg do linfoma de Hodgkin clássico são distribuídas escassamente em um fundo de linfócitos inflamatórios e tipicamente compreendem menos de 1% da massa tumoral. O material derivado do tumor a granel contém conteúdo de tumor em uma concentração insuficiente para caracterização. Portanto, a classificação de células ativadas por fluorescência usando oito anticorpos, bem como a dispersão lateral e frontal, é descrita aqui como um método de separação e concentração rápida com milhares de células HRS de alta pureza do tumor para estudo posterior. Ao mesmo tempo, porque os protocolos padrão para o sequenciamento exoma tipicamente requerem 100-1000 ng de DNA de entrada, que muitas vezes é muito alto, mesmo com a classificação de fluxo, também fornecemos um protocolo de construção de biblioteca otimizado e de baixa entrada capaz de produzir alta qualidade Dados de até 10 ng de DNA de entrada. Esta combinação é capaz de produzir bibliotecas de próxima geração adequadas para a captura de hibridação de todo o mundoIscas xome ou painéis direcionados focados, conforme desejado. Exome seqüenciamento das células HRS, quando comparado contra células T ou B intratumor saudáveis, pode identificar alterações somáticas, incluindo mutações, inserções e deleções, e alterações no número de cópias. Essas descobertas elucidam a biologia molecular das células HRS e podem revelar vias para tratamentos medicamentosos direcionados.
Introduction
Os avanços na genómica do câncer como resultado da sequenciação da próxima geração levaram a avanços significativos na identificação de alvos terapêuticos e na prognóstico para muitas neoplasias hematológicas e não hematológicas. Novas estratégias de tratamento individualizado baseadas em alterações genômicas específicas estão sendo introduzidas rapidamente em muitos tipos de tumores (revisado nas referências 1 , 2 ). Apesar do progresso significativo na genômica do linfoma, o genoma das células neoplásicas de HRS no linfoma de Hodgkin clássico (CHL) foi subexplorado. As investigações foram prejudicadas pela escassez de células neoplásicas de HRS dentro de um microambiente reativo, tornando difícil isolar populações de células HRS purificadas 3 .
O método para isolar células HRS viáveis de tumores primários foi desenvolvido por Fromm et al. 4 ,O método utiliza um cocktail de oito anticorpos, composto por CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 e CD64, para identificar inequivocamente células HRS de uma suspensão de tumor CHL. Usando esta metodologia, nós São capazes de isolar pelo menos 1.000 células HRS viáveis de suspensões celulares frescas ou congeladas de biópsias tumorais consistindo em pelo menos 10 7 células (aproximadamente 10 mg de tecido). A pureza é superior a 90% por análise citométrica de fluxo e é estimada como sendo Pelo menos 80% pela análise genômica exoma de dez casos consecutivos.
Nós refinamos uma técnica de isolamento de células citométricas de fluxo que facilitou o processo, permitindo o isolamento rápido de milhares de células HRS viáveis de tumores primários de CHL 7 . Utilizamos a técnica para produzir o que se acredita ser a primeira sequência de exomas inteiras das células tumorais em casos primários de linfoma de Hodgkin. Nossos estudos demonstram queE viabilidade de estudos de alto rendimento, em todo o genoma, de casos individuais de CHL e já levaram à identificação de novas alterações genômicas com o potencial de explicar aspectos da patogênese de CHL.
Desenvolvemos ainda um pipeline para utilizar o DNA extraído para estudos genômicos de alto rendimento. A fim de obter resultados confiáveis de cerca de 1.000 células HRS classificadas (o mínimo obtido em casos seqüenciais), desenvolvemos um procedimento de construção de biblioteca de DNA de próxima geração modificado 8 que nos permitiu aumentar a eficiência da ligação de adaptador e gerar bibliotecas de fragmentos de DNA Sem amplificação excessiva. Este método permite a análise de amostras clínicas de rotina e a detecção de mutações recorrentes e alterações cromossômicas 7 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Futuras aplicações ou direções depois de dominar esta técnica
Este trabalho permite a sequenciação exoma de amostras contendo pelo menos 10 ng de DNA. No contexto clínico, este limite exclui a maioria das amostras de aspiração com agulhas finas devido ao material insuficiente, mas inclui biópsias básicas adequadas e amostras de biópsia excisional. Isso permitirá a aquisição de dados de um conjunto maior de possíveis amostras.
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Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O desenvolvimento deste método de projeto foi financiado pelo Departamento de Patologia e Medicina de Laboratório da Weill Cornell Medical College. Reconhecemos o Programa de Treinamento Tri-Institucional em Biologia Computacional e Medicina para financiamento parcial. Gostaríamos de agradecer aos cientistas que compartilharam seu tempo e conhecimento conosco, especialmente Maryke Appel; Dan Burgess; Iwanka Kozarewa; Chad Locklear; E todos do Weill Cornell Medical College Genomics Core Facility, incluindo Jenny Zhang, Xiaobo (Shawn) Liang, Dong Xu, Wei Zhang, Huimin Shang, Tatiana Batson e Tuo Zhang.
Materials
| Petri or Cell Culture Dish (sterile) | |||
| RPMI-1640 Media | Roswell Park Memorial Institute | ||
| Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated) | |||
| Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile | |||
| RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month) | |||
| scalpel with fresh blade | |||
| 10 ml syringe (no needle) | |||
| Cryogenic vials | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes, force | |||
| Centrifuge | capable of handling 50 ml conical centrifuge tubes and providing 400g | ||
| Hepes buffer(1M, cell culture grade) | |||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Pluoronic-F68 | Thermo-Fisher | 24040-032 | |
| DNAase-I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D4527-10KU | store as 5mg/ml in RPMI in -200C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | |||
| Sort Media (PBS+2%BSA+25mM HEPES+ Pluoronic –F68 (1X)) | |||
| CD64-FITC (22) | Beckman Coulter, Miami, FL | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD30-PE (BerH83) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD5-ECD (BL1a) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) | Ebiosciences, San Diego, CA | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD20-PC7 (B9E9) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD15-APC (HI98) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD45 APC-H7 (2D1) | BD Biosciences, San Jose, CA | Can be substituted with 10 uL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested | |
| CD95-Pacific Blue (DX2) | Life Technologies, Grand Island, NY | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD2 (5 μg; clone RPA-2.10) | Biolegend, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD54 (10 μg; clone 84H10) | Serotec, Oxford, United Kingdom | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD58 (10 μg; clone TS2/9) | eBioscience, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| LFA-1 (12 μg; clone MHM23) | Novus Biologicals, Littleton, CO | For optional protocol; Titering is suggested | |
| BD CS&T Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Accudrop Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BC Versa Comp antibody capture beads | Beckman Coulter, Miami, FL | Compensation Beads | |
| BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers | BD Biosciences, San Jose, CA | any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient | |
| Wizard | Promega | A2360 | |
| 10 mM Tris-Cl buffer | NA | ||
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | ||
| S2 Sonicator | Covaris, Woburn, MA | Alternatives may be substituted | |
| microTUBE | Covaris, Woburn, MA | ||
| Low-Throughput Library Preparation Kit | Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK8221 | |
| Sybr Green | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S9430 | |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter, Miami, FL | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| SeqCap EZ Exome v.3.0 | Roche Nimblegen | 6465684001 | |
| HiSeq | Illumina | ||
| TruSeq-style Universal adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T | |
| TruSeq-style index adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG | |
| TruSeq-style PCR primer 1 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | AATGATACGGCGACCACCGAGA | |
| TruSeq-style PCR primer 2 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | CAAGCAGAAGACGGCATACGAG | |
| Nuclease Free Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | ||
| BD FACSDIVA software | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Falcon Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Flow Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
References
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