جيل من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من سرطان الجلد البشري الخلايا اللمفاوية-التسلل الورم
Summary
The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.
Abstract
نقل بالتبني من خارج الحي توسيع الخلايا الليمفاوية التسلل الورم ذاتي (TILs) يمكن التوسط الردود دائمة وكاملة في مجموعات فرعية كبيرة من المرضى الذين يعانون من سرطان الجلد المنتشر. العقبات الرئيسية لهذا النهج هي انخفاض قابلية خلايا T نقل، والناجمة عن تقصير التيلومير، وحصل على عدد محدود من TILs من المرضى. فإن خلايا T أقل متباينة مع التيلومير طويلة أن يكون فرعية الخلايا التائية مثالية لبالتبني علاج الخلايا T، ولكن توليد أعداد كبيرة من هذه الخلايا T أقل متباينة-إشكالية. هذا القيد من بالتبني علاج الخلايا التائية يمكن التغلب عليها نظريا باستخدام الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs) أن تجديد الذات، والحفاظ على التيلوميرات تعدد القدرات، وممدود، وتوفير مصدر غير محدود من خلايا تي ذاتي لالمناعي. هنا، نقدم بروتوكول لتوليد iPSCs باستخدام ناقلات فيروس سينداي لتنبيغ من العوامل برمجة في TILs. يولد هذا البروتوكولق برمجتها بشكل كامل، استنساخ خالية من ناقلات. قد تكون هذه iPSCs المستمدة سمسم-قادرة على توليد أقل متباينة-patient- وورم محددة الخلايا التائية لبالتبني علاج الخلايا التائية.
Introduction
تكنولوجيا إعادة برمجة الخلايا التي تسمح جيل من الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs) عن طريق overexpression من مجموعة محددة من عوامل النسخ واعدة للغاية في مجال العلاجات المستندة إلى الخلايا 1،2. هذه iPSCs يحمل ملامح النسخي وجينية ولها القدرة على تجديد الذات وتعدد القدرات، على غرار الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) 3-5. وقد سمح التقدم الملحوظ المحرز في تكنولوجيا إعادة برمجة خلال العقد الماضي لنا لتوليد iPSCs الإنسان حتى من خلايا متباينة عضال، مثل خلايا T 6-8. تي iPSCs المشتقة من خلية (TiPSCs) الإبقاء على نفس التكوين ترتيبها من الخلايا التائية مستقبلات (TCR) الجينات سلسلة مثل خلايا T الأصلي، والذي يسمح تجديد خلايا T مستضد معين من TiPSCs 9-11.
ما يقرب من 80٪ من الخلايا الليمفاوية التسلل سرطان الجلد (TILs) التي تم الحصول عليها من ورم المريض التعرف على وجه التحديد المرتبطة الورم المستضدات لالثانية الحفاظ على سمية الخلايا ضد الخلايا السرطانية الأصلية 12. والجدير بالذكر، انه تم العثور على التعبير عن موت الخلايا المبرمج البروتين 1 (PD-1) على TILs لتحديد ذاتي ذخيرة للورم رد الفعل، بما في ذلك تحور-مستضد مستحدث محددة CD8 + الخلايا اللمفية (13). نقل بالتبني من الجسم الحي السابقين TILs ذاتي موسع في تركيبة مع نظم lymphodepleting التحضيرية والإدارة الشاملة للانترلوكين 2 (IL-2) يمكن أن يسبب تراجعا كبيرا من سرطان الجلد المنتشر في مجموعات فرعية من المرضى 14. وعلى الرغم من النتائج المشجعة في النماذج قبل السريرية والمرضى، وبقاء الفقراء من الخلايا التائية التي غرست وجود مسارات القمعية المناعي تظهر لتقديم تنازلات الإمكانات الكاملة للبالتبني علاج الخلايا التائية. تتطلب البروتوكولات السريرية الحالية فيفو تلاعب واسعة من خلايا تي ذاتي من أجل الحصول على أعداد كبيرة. وهذا يؤدي إلى توليد خلايا T متباينة عضال التي لديها نسبة النفوق، وانخفاض prolالقدرة iferative، ومستويات عالية من PD-1 15.
هذا القيد من بالتبني علاج الخلايا التائية يمكن التغلب عليها نظريا باستخدام iPSCs التي يمكن أن توفر مصدرا غير محدود من خلايا تي ذاتي لالمناعي. لقد ذكرت مؤخرا إعادة برمجة سرطان الجلد TILs معربا عن مستويات عالية من PD-1 فيروس سينداي (SEV) ترنسدوكأيشن بوساطة من عوامل النسخ الأربع، OCT3 / 4، SOX2، KLF4، وج-MYC 16. في حين ناقلات الارتجاعي تتطلب الاندماج في الكروموسومات المضيفة للتعبير عن الجينات إعادة برمجة، ناقلات SEV غير قابلة للدمج ويتم التخلص في نهاية المطاف من السيتوبلازم. إعادة برمجة الكفاءة هو أعلى من ذلك بكثير مع نظام SEV مقارنة مع الفيروسة البطيئة أو الارتجاعي ناقلات 6-8. وعلاوة على ذلك، يمكن SEV إعادة برمجة خلايا تي تحديدا في الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMCs)، في حين أن بعض الحيوانات المستنسخة التوجيهية التي تم إنشاؤها بواسطة الفيروسة البطيئة أو ناقلات الارتجاعي يمكن أن يكون من الأنساب nonlymphoid 6-8. هنا، فإننا التفاصيلإجراءات تنفيذها للعزلة وتفعيل سرطان الجلد البشري TILs ولتوليد iPSCs المستمدة سمسم باستخدام نظام برمجة SEV.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، أثبتنا بروتوكول للبرمجة TILs سرطان الجلد لiPSCs التي كتبها التنبيغ بوساطة SEV للالنسخ أربعة عوامل OCT3 / 4، SOX2، KLF4، وج-MYC. هذا النهج، وذلك باستخدام نظام SEV لإعادة برمجة خلايا T، ويقدم ميزة أسلوب غير دمج-7.
وأظهرت دراسة سابقة أن نظا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.
Materials
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Primate ES Cell Medium | Reprocell | RCHEMD001 | warm in 37 ℃ water bath before use |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 | |
| ReproStem | Reprocell | RCHEMD005 | warm in 37 ℃ water bath before use |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Wakao, H., et al. Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).
- Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients. J Immunother. 26, 332-342 (2003).
- Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Saito, H., et al. Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 11 (2016).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).
- Fujie, Y., et al. New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood. PLoS One. 9, e113052 (2014).
