土壌中の微生物のリン脂質脂肪酸の抽出と分析

注：必ず、適切な個人用保護具（P​​PE）は、プロトコル全体に着用されていることを確認してください。ガラス製品は素手で触れないようにしてください。指、毛、グリース、油および炭化水素からの脂質は、すべての潜在的な汚染物質です。きれいなガラス製品を取り扱う際には、必ず70％アルコールでニトリル手袋とリンス手袋を着用してください。 分析用ガラス器具の作製 使い捨てガラス製品（ 例えば 、遠心分離管） 450ºCで4時間半マッフル炉でアルミ箔と熱で包みます。 ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）はキャップを-lined リン酸洗剤中で1時間キャップを浸し、その後、熱水およびリン酸洗剤で洗浄ブラシで洗浄します。水道水で石鹸を洗い流します。 彼らはあまりにも長い間浸漬した場合のライナーは、キャップの外に落ちることとしてだけで1時間酸浴中でプレイス（5％HCl）は（長く放置しないでください。3回すすぎ水道水インチ蒸留水で3回洗浄します。 40ºCのオーブンで乾燥しました。 再利用可能なガラス製品（ 例えば 、10ミリリットル、15ミリリットル、45ミリリットルバイアル/ジャー） お湯とリン酸洗剤での洗浄ブラシで洗浄します。酸浴（5％のHCl）で一晩中、水道水と場所との石鹸を洗い流します。 40ºCのオーブン中で乾燥した後、蒸留水で3回すすぎ、その後、水道水で3回すすいでください。 きれいなアルミホイルで包む（50ミリリットルの瓶は、個別包装され、他のガラス製品は、サンプルバッチでラップされ、 例えば 、20）と450ºCで4時間半のためのマッフル炉内の熱。 体積ガラス製品（ 例えば 、メスフラスコ） お湯とリン酸洗剤での洗浄ブラシで洗浄します。酸浴（5％のHCl）で一晩中、水道水と場所との石鹸を洗い流します。 、水道水で3回すすぎ、蒸留水で3回リンスし、次いで乾燥オーブン中で40 AT＆＃186; C。 マッフル炉で容積ガラス器具を置かないでください-少量の溶媒（ 例えば 、メタノール）で3回すすぎ使用前に。 土壌サンプルの2収集および処理PLFA分析の前に滅菌バッグに土壌サンプルを収集し、これらはすぐに分析することができない限り、できるだけ早くそれらを凍結。直前まで冷凍庫（-80ºC）で保管サンプルは、サンプルの凍結乾燥を続行します。凍結乾燥機の指示に従い、サンプルの乾燥バッチを凍結。 新しい標識滅菌バッグに各凍結乾燥サンプルを転送します。 PLFA抽出のための事前標識こもり遠心管に袋に凍結乾燥物質から試料を秤量。 注：一般的なガイドラインは、有機材料（炭素含有量> 17重量％）のために、ミネラル土壌サンプルの3.0グラムまでの0.5グラムを使用することです。各サンプルの録音サンプル重量。 すべての10のサンプルについて、また、秤量分析のために、すべての20の試料のための追加の重複は、ブランク（ すなわち 、その中の任意のサンプルを持っていない遠心チューブ- PLFA抽出プロセス中の任意の潜在的な汚染を識別するための対照として使用します）。同時に試料管のプロセスのバッチ。 注：20のサンプルのセットは、23の試料管（サンプル1〜10、サンプル10の1つの重複、サンプル12〜22、試料22、及び23の試料管の1つのブランク=バッチの重複）のバッチに対応します。 注：GC分析のためにそれらを準備し、それらのすべてを実行する前に、サンプルのバッチで、その後、その後、抽出、分離、メチル化を実施します。これは、何かがうまくいかない、と必要な繰り返し抽出数を下げるに役立つ可能性がある場合間違いが起こった場所を特定するのに役立ちます。 3. PLFAテクニック（手順は、個々のサンプルのためのものですが、一度に一つのバッチ全体を完了） 注：手順で説明したPLFA技術のすべてのステップ1-3は、以下の適切なPPEを使用し、ラボの安全に関する注意事項を以下のドラフト内で行われるべきです。 抽出（ステップ1）。 50mlの蒸留KOHの14グラムを溶解することにより、5.0 M KOHを準備し、脱イオン水（のdH 2 O）。 dH 2 O 400mlに31.52グラムのクエン酸一水和物を溶解し、0.15Mクエン酸緩衝液を調製します5.0 M KOHを加えてpHを4.00±0.02に調整します。約5.0 M KOH 45-50 mlを4.00にpHを調整する必要があります。 pHを調整すると、容量フラスコを用いて、1,000 mlのクエン酸緩衝液を希釈します。使用していない（最長1ヶ月間）冷蔵庫にクエン酸緩衝液を保管してください。 （これは23サンプルのバッチのための十分なサロゲート標準を提供します）25ミリリットルのクロロホルム中のストック溶液（10mg / ml）250μlの希釈してノナデカンサロゲート標準毎日PC（0：0/19 19）を準備します。 PCの0.5ミリリットルを追加（19：0/19：0）のサンプルの遠心チューブにサロゲート標準溶液。 Aⅰ）2.0ミリリットルクエン酸緩衝液、ⅱ）2.5ミリリットルのクロロホルム、およびiii）5.0ミリリットルのメタノール：次の順序で土壌サンプルへブライとダイアー抽出をddを。 30秒間PTFE内張りキャップと渦とキャップサンプル; 2時間転倒混和振盪機に配置します。 上のキャップで15分間、226×gで遠心分離します。パスツールピペットで上清をオフに描画し、ラベルされた45ミリリットルのガラスバイアルに移します。 各サンプルにブライとダイアー抽出剤の第二ラウンドを追加し、上記の手順4と5を繰り返します。パスツールピペットで上清をオフに描画し、同じラベルされた45ミリリットルのガラスバイアルに移します。 クエン酸緩衝液I）5.0ミリリットルのクロロホルム、およびii）5.0ミリリットル：上清を含む標識45ミリリットルのガラスバイアルに追加します。 30秒間白PTFE内張りキャップと渦ガラスバイアルとキャップ。 （酸化を避けるために）それは暗所で室温で一晩放置します。 慎重に45ミリリットルバイアルの上部の水相（ない真空が利用可能でない場合、ピペットはaqueを通じて低下しなければならないをオフに真空有機相をピペッティングする際、ピペット内の任意のを収集しないように非常に注意深くなどのOU相）。ラベルされた15ミリリットルバイアルにピペット低い有機相。 室温で圧縮されたN 2下、15ミリリットルバイアルの場所バッチ（酸化を避けるため）。バイアル内の液体の表面フリルが、バイアルの側面を登るしないように、N 2フローを設定して、ゆっくりとクロロホルムを蒸発。 ステップ2に進んで準備ができるまで（個別にではなくバッチでラップ）アルミホイルに包んで-20ºCの冷凍庫にPTFE内張りキャップや店舗サンプルにねじ込みます。 脂質分画（ステップ2） ガラスタンクにスピゴットとSPEカラムホルダーを配置します。差込口に新しいSPEカラム（シリカ、500 mgを、6ミリリットル）を挿入します。 （サンプルを混合を避けるためにお勧めします）、必要に応じてラベル列。 （アセトンの5ミリリットルを追加し、それはを通して排水させることで、各列を調整してから、5ミリリットルのクロロホルムの2つの加算を追加総容量= 10mL）で。第クロロホルム洗浄がフリット上記〜1ミリメートルまで流出した後、栓を閉めることを許可します。 優しくバイアル、ボルテックスする0.5ミリリットルのクロロホルムを添加することにより、（ステップ1の終了時に15ミリリットルバイアルに保存された）サンプルを再溶解します。転送パスツールピペットを用いて、SPEカラムに試料を再溶解しました。 2転送（サンプル当たり1ミリリットルのクロロホルムの総転送量）の合計のために繰り返します。 カラムの中心に直接脂質サンプルを置き、タンクに完全に排水するための溶剤ができます。 各カラムにクロロホルム5mlを添加することにより中性脂質を溶出させます。タンク内に完全に排水するための溶剤を許可します。 各カラムに5mlのアセトンを添加することにより脂質を溶出させます。収集タンクに完全に流出する溶媒を許可します。 列を削除するタンクから立って、真空装置でタンクを排水。タンクにクリーンで標識された遠心分離管にラックを挿入します。タンク上のカラムスタンドを取り付けます。上記表示した列は、標識されたCENTRで並ぶ必要があります以下ifugeチューブ。 各カラムに5mlのメタノールを添加することによって、遠心管にリン脂質を溶出させます。 SPEカラムがそれらを処分する前に、ドラフト内で完全に乾くまで待ってください。圧縮されたN 2下、室温でドライダウンのリン脂質画分。 ステップ3に進んで準備ができるまでアルミホイルに包んで-20ºCで冷凍庫中のPTFE内張りキャップと店舗サンプル上のN 2ネジ（個別にではなくバッチでラップ）でパージチューブ。 脂質メチル化（ステップ3）。 37ºCに設定湯浴をオンにします。千ミリリットルのメスフラスコを用いて、千ミリリットルのdH 2 Oで57.1ミリリットルの氷酢酸を溶解させることによって（すでに行われていない場合）、1M酢酸を準備します。この溶液は、最大3ヶ月間室温で保存することができます。 。 メタノール性KOHのバッチを準備します。 40ミリリットルのメタノールに0.45グラムのKOHを溶解させることによって、0.2M KOH溶液を準備します。に従ってKOHの量とメタノールを調整しますステップ3でnticipatedバッチサイズは、毎日この溶液を調製します。長期間保管しないでください。 冷凍庫から（ステップ2の後に格納されている遠心管のように）サンプルを削除し、サンプルは室温にさせます。 1.0ミリリットルのメタノールKOH続いて、各サンプルに0.5ミリリットルのクロロホルムおよび0.5ミリリットルのメタノールを追加します。キャップチューブしっかりPTFEで裏打ちキャップを有します。混合する渦巻。 30分間37ºC浴中に密封されたサンプルを置きます。水位が試料液のレベルより上の1〜2ミリメートルの最小値であることを確認してください。削除して、サンプルを冷却することができます。サンプルは、水浴中であるが、サンプルのID（PTFE内張りキャップで10mlのガラスバイアル）で小さなガラスバイアルにラベルを付けます。 各サンプルとスワールに2.0ミリリットルのヘキサンを追加します。その後、再び混合するために、各サンプルとスワールに1.0 M酢酸0.2ミリリットルを追加します。相分離が見えるようになるはずです。 相を破るために各サンプルにのdH 2 Oの2.0ミリリットルを追加します。 30秒間ボルテックスサンプル。その後、2分間226×gで遠心分離サンプル。 使い方ショートパスツールピペット、標識された10ミリリットルバイアルをきれいにする上相を転送します。下部（水）相のいずれかを転送しないように注意してください。 各サンプルの遠心分離管やスワールに2.0ミリリットルのヘキサンを追加します。 30秒間ボルテックスサンプル。その後、2分間226×gで遠心分離サンプル。 ショートパスツールピペットを用いて、再度標識10mlのガラスバイアルに上相を加えます。 N 2下、室温で標識された10ミリリットルガラスバイアル中の溶媒蒸発させます。 GC分析を進める準備ができるまで（個別にではなくバッチでラップ）アルミホイルに包んで-20ºCの冷凍庫にPTFE内張りキャップや店舗サンプルにねじ込みます。すべてのサンプルにラベルを付けてください。 ガスクロマトグラフ（GC）分析 注：個々のPLFAsの同定および定量化は、FIDまたはMS検出器のいずれかに接続されたGCを使用して達成されます。命令は以下のGC-FIDのためであるが、試料調製は、GC-MSに有効であろうWとしてエル。 285ºCへの初期温度190ºC、ランプ10ºC/分：GC-FIDシステムの例のセット​​アップは、以下の温度プロトコルで0.33ミクロン（5％ – フェニル） – メチル列×0.2ミリメートル×25メートルを含むであろう、0.42分31を保持し 、310ºCに9.5分、ランプ60ºC/分を保持します。 （レコードが0.1 mgの重量を追加しました）100ミリリットルのヘキサンに0（デカン酸メチル）：MeC10の一滴を追加することにより、GC内部標準（ISTD）を準備します。 GCへのガスをオンにしてから、GCの電源をオンにします。 H 2は 、N 2とエアシリンダがオープンし、分析を実行するのに十分なガスが存在することがあることを確認します（H 2は 500 psiの下に取得することはありません）。 良いキャリブレーションの条件はヘキサン空白が続く脂肪酸の混合物を含むキャリブレーション標準を実行することによって満たされていることを確認してください。個々の脂肪酸の同一性は、手作業での標準について得られた保持時間との比較に基づいて割り当てることができ、またはこれはAUTOMATICAすることができLLY市販のソフトウェア31を使用して割り当てられました。全ての場合において、明確な同定は、MS検出器2を用いて達成することができます。 注：良いキャリブレーションの追加の兆候は平らなベースラインとヘキサンリンスで無汚染が含まれます。 サンプル応答が弱いことが予想される場合（あるいは、そのような非常にのように、50〜75マイクロリットルを使用ISTD溶液​​150μl中（脂質メチル化ステップ3から10mlのガラスバイアル中に含まれている）各PLFAサンプル残留物を溶解し、GCバ​​イアルに移します砂質土）。 2μLのサンプルの注入量を設定します。 300ºCにFID温度を設定します。キャリアガス（流速1.3 ml /分）、30の分割比としてH 2を用いて、250ºCの入口温度を使用して、サンプルを実行する：1。