机器人平台的高通量原生质体分离和转型

近年来，一直放置在转基因作物的设计克服了各种疾病^1，赋予抗除草剂^2，赋予干旱^3,4和耐盐⁵显著动力，防止虫食^6，提高生物产量^7，降低细胞壁顽抗^8。这种趋势已经通过新的分子工具的发展，用于产生转基因植物，包括使用CRISPR和TALENS ⁹基因组编辑，基因通过的dsRNA ^10，miRNA的^11，和siRNA ¹²沉默辅助。虽然这些技术简化了转基因植物的一代，他们还创建了一个瓶颈，其中产生的转基因植物的数量之多，无法使用依赖于植株再生的传统系统进行筛选。与此相关的瓶颈，而沉默和基因组编辑构建体能够迅速地插进植物，许多目标性状不能产生所期望的效果，这通常没有发现直到植物在温室中进行分析。在这项工作中，我们开发了用于植物原生质体的快速，自动化，高通量筛选的方法，具体而言，以解决在大量的基因组编辑和基因沉默靶的早期筛查的当前瓶颈。

使用原生质体的，相对于完整的植物细胞，具有几个优点对自动化平台的开发。首先，原生质体的植物细胞壁的消化后分离，以及与此屏障不再存在，转化效率提高^13。在完整的植物细胞，只有两种用于转化很好地建立的方法，基因枪法¹⁴和农杆菌介导的转化^15。这些方法都不能够容易地转化为液体处理平台，生物射弹需要TRANSFO专门的设备细则第十五，而农杆菌介导转化需要共培养和随后的去除细菌。无论是适合于高通量方法。在原生质体的情况下，转换是经常使用聚乙二醇（PEG）介导的转染^16，其仅需要几个溶液的交流，并非常适合用于液体处理平台进行。第二，原生质体，顾名思义，是单细胞培养物，从而与在植物细胞培养物结块和链的形成相关的问题，没有在原生质体观察。在使用基于平板分光光度计，细胞凝集快速筛选而言，或细胞在多个平面将导致难以取得一致的测量。因为原生质体也比其培养基稠密，它们沉淀到孔的底部，形成一单层，这有利于对基于板状光度法。最后，尽管植物细胞悬浮培养物是PRIMAR随手从愈伤组织¹⁷衍生的原生质体可以从多种植物组织的收获，从而导致识别组织特异性表达的能力。例如，能够分析根级或一个基因的叶特异性表达可以是表型的预测很重要的。由于这些原因，在该工作开发的协议使用从广泛使用的烟草（ 烟草属）“亮黄色'2（BY-2）悬浮培养物分离的原生质体进行了验证。

在BY-2悬浮培养已被描述为高等植物的“的HeLa”细胞，因为在植物细胞中¹⁸的分子分析其无处不用途。最近，BY-2细胞已被用于研究植物的影响压力^19-22，细胞内蛋白质定位^23,24，以及基本的细胞生物学^25-27表明在植物生物学这些培养物的广泛的实用性。 BY-2培养物的一个附加的优点是到培养物与阿非迪霉素同步，这可导致增强的基因表达的重现能力研究^28。此外，已开发了用于使用低成本酶^29,30 BY-2原生质体的提取，如传统上用于产生原生质体的酶是成本过高的高通量系统。因此，下面描述的协议已被使用BY-2悬浮培养验证，但它应该是易于进行的任何植物细胞悬浮培养。证明的概念实验使用CaMV 35S启动子的控制下，从硬盘珊瑚滨橙色荧光蛋白（OFP）报告基因（pporRFP） 滨 ³¹进行。