Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim
Summary
Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.
Abstract
araştırma, hastalık modelleme, farmasötik ve klinik uygulamalar için insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) yararını en üst düzeye çıkarma kardiyomiyositlerde dahil fonksiyonel hücre tipleri, büyük ölçekli üretim için güçlü bir yöntem gerektirir. Burada WNT, TGF-p, ve SHH'nin zamansal manipülasyon sinyal yolları statik asma ve karıştırılan süspansiyon, biyoreaktör sistemleri hem de tek bir hücrenin yüksek verimli kardiyomiyosit farklılaşma geçişli hPSC hatları yol açtığını göstermektedir. Bu stratejiyi kullanarak sürekli olarak çok sayıda hPSC çizgilerle doğrulanmış kültür 15 gün sonra> 80% cTnT'nin-pozitif hücrelerin, içeren, ~% 100 dayak parçacıklarının ile sonuçlanmıştır. Biz de şu anda 42 hPSC hatlarında doğrulandı başarı olan tek hücre pasajlarının, adapte olmayan hücre hatları ile kullanım için bu protokolün bir varyasyonu sunuldu. Bu protokolleri kullanılarak oluşturulan kardiyomiyositlerde soy-spesifik belirteçleri ve gösteri beklenen electrophys ifademalarla işlevleri. Bizim protokol insan kardiyomiyositlerde büyük ölçekli üretim için, basit, verimli ve sağlam bir platform sunuyor.
Introduction
İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) de dahil olmak üzere insan pluripotent kök hücreler (hPSCs), üç embriyonik germ 1,2 hücrelerine ayırt etmek için kendini yenileme ve kapasite yeteneği var. Bu özelliklerinden dolayı, hPSCs klinik uygulamalar 8 için potansiyel yüksek verimli ilaç tarama ve toksisite deneyleri 6,7 insan hastalık 3-5, modellemek için hastalık ilgili hücre tiplerinin üretimi ve ölçeklenebilir üretim için değerli ve sınırsız kaynağı sağlamak ve . hPSCs gelen kardiyomiyositlerinin nesil nedeniyle ilgili hayvan modellerinin olmaması ve / veya etkilenen birincil dokuların durumu özellikle daha önce bizim yetenekleri kapsamı dışındadır karmaşık insan kalp ve damar hastalıkları mekanizmaları ve bunların olası tedaviler, araştırmak için fırsat sağlar.
hPSCs n yukarıda belirtilen tüm uygulamalarzenginleştirilmiş ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde ve çok sayıda üretim ecessitate. Böylece, kullanılabilirlik önemli çoklu hPSC hatları için, verimli, tekrarlanabilir ve uygun in vitro kalp farklılaşma protokolde ölçeklenebilir bir. Konvansiyonel kardiyomiyosit farklılaşma protokolleri gibi sitokinler 11 ve protein transdüksiyon yöntemleri 12 kokteyl ile embriyoid vücut oluşumu 9, ko-kültür teknikleri 10, indüksiyon gibi farklı stratejiler istihdam var. Bu tekniklerin içinde ilerlemelere rağmen, çoğu hala, yoksul verimlilik muzdarip pahalı büyüme faktörlerini gerektiren veya birden fazla hPSC hatlarını kullanmaya çalışırken sınırlı evrenselliğini sunuyoruz. Bugüne kadar, bu zorluklar hayvan modellerinde hücre tedavisi çalışmaları için hPSC türetilmiş kardiyomiyositlerinin üretimine sınırlarını yanı sıra ilaç keşfi 13 ilaç endüstrisi belirledik. Bu nedenle, büyük için sağlam ve uygun fiyatlı tekniklerin geliştirilmesiölçeklenebilir kültür sistemlerinde fonksiyonel hPSC türetilmiş kardiyomiyositlerinin ölçeğindeki üretim büyük ölçüde ticari ve klinik uygulamaları kolaylaştıracaktır.
Bu yazıda, yüksek büyük ölçekli üretimi için bir yöntem de dahil olmak üzere kaynak ve kültür yöntemleri, çeşitli oluşturulan HESC ve hiPSCs yüksek etkinlik, tekrar üretilebilirlik ve uygulanabilirliği olan bir düşük maliyetli ve entegre kalp farklılaşma sisteminin gelişimi sunulmuştur bir biyoreaktör kullanılarak hPSC türetilmiş kardiyomiyositlerde zenginleştirilmiş popülasyonları. Buna ek olarak, bu tür yeni kurulan hiPSCs veya hastalık mekanizmasının analizi ile ilgili hPSC hatlarının büyük bir kohort serbest ve / veya tek bir hücre kültürü besleyici üzere uyarlanmış olup hPSC hatları, bu protokol optimize ettik.
Protocol
Representative Results
Discussion
hPSCs türetilen kardiyomiyositlerinin, gelecekte, rejeneratif tedaviler, insan hastalığı modelleme, ilaç tarama / toksisite testinde kullanılmak üzere son derece çekici bir kaynağıdır ve. Bununla birlikte, bu hücreler kullanılarak başlıca engellerden biri, bunların etkili bir kullanım için yeterince yüksek kaliteli malzeme sağlamak yeteneğidir. Bizim açıklanan protokolü kullanarak, bu sınırlama ortadan kaldıran bir yöntem sunuyoruz.
Son zamanlarda, cardiogenesis k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by grants provided from Royan Institute, Iranian Council of Stem Cell Research and Technology, the Iran National Science Foundation (INSF), the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC; 354400), the National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia (G11S5629), and the New South Wales Cardiovascular Research Network. HF was supported by a University International Postgraduate Scholarship from the University of New South Wales, Australia. RPH was supported by a NHMRC Australia Fellowship. The authors express their gratitude to the human subjects who participated in this research.
Materials
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
| RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
| DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
| Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
| ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
| IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
| Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
| Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
| Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2010).
- Vitale, A. M., Wolvetang, E., Mackay-Sim, A. Induced pluripotent stem cells: a new technology to study human diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 843-846 (2011).
- Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circ Res. 115, 556-566 (2014).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. Korean J Intern Med. 29, 547-557 (2014).
- Kimbrel, E. A., Lanza, R. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 681-692 (2015).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108, 407-414 (2001).
- Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107, 2733-2740 (2003).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- Fonoudi, H., et al. ISL1 protein transduction promotes cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells. PLoS One. 8, e55577 (2013).
- Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev (Orlando). 23, 53-68 (2009).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol Biol. 767, 137-146 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109, E1848-E1857 (2012).
- Gonzalez, R., Lee, J. W., Schultz, P. G. Stepwise chemically induced cardiomyocyte specification of human embryonic stem cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11181-11185 (2011).
- Fonoudi, H., et al. A Universal and Robust Integrated Platform for the Scalable Production of Human Cardiomyocytes From Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2015).
- Abbasalizadeh, S., Larijani, M. R., Samadian, A., Baharvand, H. Bioprocess development for mass production of size-controlled human pluripotent stem cell aggregates in stirred suspension bioreactor. Tissue Eng Part C Methods. 18, 831-851 (2012).
- Larijani, M. R., et al. Long-term maintenance of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells in suspension. Stem Cells Devt. 20, 1911-1923 (2011).
- Baharvand, H., Larijani, M. R., Yousefi, M. Protocol for expansion of undifferentiated human embryonic and pluripotent stem cells in suspension. Methods Mol Biol. 873, 217-226 (2012).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11, 855-860 (2014).
- Minami, I., et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell reports. 2, 1448-1460 (2012).
- Buskirk, A. R., Liu, D. R. Creating small-molecule-dependent switches to modulate biological functions. Chem Bio. 12, 151-161 (2005).
- McKinsey, T. A., Kass, D. A. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving beneath the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 6, 617-635 (2007).
- Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102, 493-507 (2009).
- Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng Part A. 17, 1901-1909 (2011).
- Hwang, Y. S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16978-16983 (2009).
- Nguyen, D. C., et al. Microscale generation of cardiospheres promotes robust enrichment of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3, 260-268 (2014).
- Kempf, H., et al. Controlling expansion and cardiomyogenic differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 3, 1132-1146 (2014).
- Hemmi, N., et al. A massive suspension culture system with metabolic purification for human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3, 1473-1483 (2014).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell stem cell. 12, 127-137 (2013).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat meth. 10, 781-787 (2013).
- Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7, 394-410 (2015).
