Detta manuskript ger ett tekniskt förfarande som kan användas för att karakterisera C1498 cellkulturer in vitro och akut leukemi inducerades i möss efter deras injektion. Fenotypiska och funktionella analyser genomförs med hjälp av flödescytometri, immunfluorescensmikroskopi, cytokemi och May-Grünwald Giemsa färgning.
Intravenös injektion av C1498-celler i syngena eller kongena möss har utförts sedan 1941. Dessa injektioner resultera i utvecklingen av akut leukemi. Emellertid, arten av denna sjukdom har inte blivit väl dokumenterade i litteraturen. Här ger vi ett tekniskt protokoll för karakterisering C1498-celler in vitro och för att bestämma beskaffenheten av den inducerade leukemi in vivo. Den första delen av detta förfarande är inriktad på att fastställa hematopoetisk härstamning och stadiet av differentiering av odlade C1498 celler. För att uppnå detta, är multi-parametrisk flödescytometrisk färgning används för att detektera hematopoetiska cellmarkörer. Immunfluorescensmikroskopi, cytokemi och May-Grünwald Giemsa färgning utförs sedan för att bedöma uttryck för myeloperoxidas, aktiviteten hos esteraser och cellulär morfologi, respektive. Den andra delen av detta protokoll är tillägnad beskriver leukemi sjukdom som induceras ivivo. Det senare kan uppnås genom att bestämma frekvenserna av leukemiska och inneboende celler i blodet, hematopoetiska organ (t ex benmärg och mjälte) och icke-lymfoida vävnader (t ex lever och lungor) med användning av specifik färgning och flödescytometri analyser. Beskaffenheten av den leukemi bekräftas sedan med användning av May-Grunwald Giemsa-färgning och färgning för specifika esteraser i benmärgen. Här presenterar vi de resultat som erhölls med hjälp av detta protokoll i åldersmatchade C1498- och PBS-injicerade möss.
Akut myeloisk leukemi (AML) kännetecknas av okontrollerad spridning av hematopoetiska myeloidceller som blockeras i olika stadier av mognad. Denna dysreglering kan påverka granulocytiska, monocytiska, erytrocytiska eller megaryocytic differentieringsvägar 1. AML-celler ansamlas i benmärgen, vilket leder till försämrad hematopoes, vilket resulterar i trombopeni, lymfopeni och anemi. Leukemicellema invaderar också blodet och icke-lymfoida organ.
Den C1498 musmodell har använts i årtionden som en modell för akut leukemi eftersom cancerceller isolerades från en leukemisk 10-månader gamla C57BL / 6 (H-2b) honmus 1941. Litteraturen beskriver invasionen i blodet , hematopoetiska organ (t.ex., mjälte och lymfkörtlar) och icke-hematopoetiska organ (t.ex. lever, lungor, äggstockar och njurar) av mycket proliferativa C1498 celler efter de injicerades via en itravenous, subkutan eller intraperitoneal väg till mottagliga möss 2-4. Emellertid var detta musmodell rapporterats inducera antingen granulocytiska 2,5 eller myelomonocytär 6 leukemi. På senare tid, en studie som publicerades i 2002 beskrev denna typ av cancer som murin NKT cellsleukemi 7. Således skiljer litteraturen om denna typ av C1498 cellinje och tillhörande leukemi det inducerar i möss. Dessa skillnader är främst på grund av en brist på detaljerad och uppdaterad publicerad information om cellerna och leukemisjukdomar i allmänhet, eftersom många studier genomfördes på 1950 – 70-talet.
Här ger vi ett detaljerat protokoll för att beskriva hur man karaktärisera C1498-celler och analysera arten av den leukemiska sjukdom som induceras genom deras intravenös injektion i möss. Den första delen av detta protokoll är tillägnad en beskrivning av C1498-celler som har odlats in vitro. fluorescerande antiorgan riktade mot ytan och intracellulära hematopoietiska markörer användes för att bestämma deras fenotyp med användning av flödescytometri. Närvaron av myeloperoxidas bedömdes med hjälp immunfluorescensmikroskopi, var deras hematopoetisk härstamning och differentiering skede utvärderas med hjälp cytokemi att bedöma aktiviteten av esteraser, och May-Grünwald Giemsa färgning utfördes. De C1498-celler sedan injicerades i möss, och akut leukemi sjukdom som inducerades beskrivs i den andra delen av detta manuskript. Samma tekniker användes för att bestämma de frekvenser och de fenotyper av leukemiska och inneboende cellerna i benmärgen, perifert blod, mjälte och icke-hematopoetiska organ (lever och lungor).
Detta protokoll är mycket reproducerbar, och de data som presenteras här kommer att hjälpa forskare att bedöma effekterna av nya terapeutiska strategier. Denna leukemi musmodell har redan använts för att testa immunterapi närmar sig ennd olika cancercellgifter 8,9. Deras effektivitet utvärderades genom att bestämma utvecklingen av tumörbördan och överlevnadstal. Protokollet kan användas för att ge ytterligare information om fördelningen och uppehälle av leukemi och andra hematopoetiska cellpopulationer under behandlingen.
I tidigare studier var det C1498-cellinjen beskrivs som en inducerare av akut granulocytisk 5, myelomonocytisk 6 eller NKT 7 celleukemi. Men demonstrativa data i litteraturen var antingen frånvarande eller ofullständig. Protokollet presenteras här använder olika tekniker, såsom flödescytometri, immunofluorescens, MGG färgning och cytokemiska analyser, att karakterisera odlade C1498-celler och för att fastställa vilken typ av leukemi som induceras i möss när de injiceras.
När vi fenotypades i C1498 vitro odlade celler efter immunfärgning och flödescytometri analyser utfördes, observerade vi vissa begränsningar, eftersom dessa celler uttryckte några cellyte hematopoetiska markörer som tidigare har beskrivits i litteraturen 6,7. I överensstämmelse med våra resultat, gjorde Labelle et al. Inte observera cellytan uttryck av mogen TCR på C1498-celler med hjälp av flödes cytometry färgning. Däremot ansåg de att de är en NKT cellinje efter att de upptäckt CD3s och TCRVβ8.2 mRNA 7. Vi observerade också intracellulär expression av TCRVβ kedjor och CD3s molekyler i de flesta av cellerna (> 70%), men deras hematopoetiska härstamningar kunde inte fastställas eftersom det fanns också samtidig intracellulär expression av Mac-3-molekylen.
Myeloperoxidas, MGG färgning och bedömningar för att analysera funktionella esteraser använder cytokemi visade att C1498 cellinje hade en myeloid ursprung och bestod av monoblasts och myeloblaster. Dessa resultat var samstämmiga med andelen Mac-3 + celler som erhölls i flödescytometri färgning analys. Även om det inte kvantitativ, dessa steg utgör viktiga experiment som ska utföras. De är i, så långt, den bästa existerande metoder för att karakterisera den härstamning och differentieringsstadiet av hematopoietiska celler som uttrycker ingen eller few specifika fenotypiska markörer.
Flödescytometri färgning var till hjälp för att visa utvecklingen av akut leukemi i kongena möss efter C1498-celler injicerades intravenöst. De CD45.2 + C1498-celler som infiltrerade in i perifert blod och olika organ isolerades och deras frekvenser bestämdes. Kvantifiering genomfördes också för att analysera inneboende medullär och mjältceller efter immunfenotypning. Begränsningar påträffades när C1498 cellfenotyp undersöktes i organ som de uttryckte några hematopoetiska markörer (endast ett fåtal av dem var B220 +). För att definiera vilken typ av observerade akut leukemi, May-Grünwald Giemsa färgning och en analys av verksamheten monocytiska och granulocytiska esteraser utfördes med användning av benmärg. Resultaten visade att C1498 celler bevarat sin myeloblastisk och monoblastic morfologi och funktion, avslöjar uppkomsten av myelomonocytär leukemi.
<p class = "jove_content"> Med hänsyn till de kritiska steg som beskrivs i detta protokoll, bör särskild uppmärksamhet ägnas åt pH när de utför cytokemiska reaktioner och MGG färgning eftersom fel i pH kan leda till felaktiga tolkningar av resultaten. Till exempel, är α-naftyl butyrat esterasaktivitet specifik för monocytiska celler endast vid ett pH av 6,0, eftersom granulocyter och lymfocyter också kan färga positiva för detta test vid högre pH-värden. Fixering cellerna inte rekommenderas innan du utför MGG färgning, och vi visade att endast CAF fixering lämnat tillfredsställande resultat när de utför esteraser cytokemiska reaktioner med hjälp av C1498-celler. Att bevara uttrycket av CD115-molekylen och dess detektering genom flödescytometri, bör alla proven (t.ex., blod, benmärg och mjälte-celler) förvaras på is under förfarandet. Om ingen färgning observeras i flödescytometri och / eller immunofluorescens experiment referens av antikropparna, deras lagrings rebör kontrolleras commendations och deras spädningar. Referenserna anges i material / utrustning tabellen har valts ut för flödescytometri eller immunofluorescens applikationer. De primära / sekundära antikroppar eller deras konjugerade fluoroforer kan ha förlorat sin verksamhet på grund av olämplig förvaring (t.ex. exponering för ljus eller värme), felaktig utspädning, omfattande frysning / upptining eller användning av förorenade buffertar. Kör positiva kontroller för att säkerställa att de fungerar korrekt. Använd musen benmärg eller mjälte härledda celler som är kända för att uttrycka proteiner av intresse. För att undvika hög bakgrund och icke-specifik färgning, se till att cellerna tvättas ordentligt och hålls vid hög luftfuktighet (för immunofluorescens) och att antikropparna späds enligt anvisningarna. Använd samma koncentration och utspädning för isotypkontrollantikropp och den primära antikroppen för att noggrant bestämma bakgrundsnivån i provet. För esteras cytokemi experimentreagens kan testas med hjälp av positiva och negativa kontrollobjektglas som innehåller renat mus mjälten granulocytiska (Ly6G +) och monocytiska (CD115 +) celler.Det förfarande som beskrivs i denna studie visade att många av de leukemi funktioner som observerats hos möss efter injektion av C1498-celler delade gemensamma kännetecken med humant akut myelomonocytär leukemi 11,12. De invaderade leukemiceller resulterade i en minskning av mogna och omogna (progenitorceller och prekursorer) medullär hematopoetiska celler. C1498-celler är närvarande vid hög frekvens (> 20%) i det perifera blodet, som är monocytiska celler. Hepatomegali och splenomegali observerades att resultatet av infiltration av leukemiceller, och signifikanta ökningar i B-lymfocyter och myeloidceller observerades också att följa med splenomegali. Trombocytopeni observerades också när blodplättar tal uppskattades med hjälp av en hematologianalysator.
Det var shown, med hjälp av in vitro-experiment, som C1498 celler hämmar normal murin hematopoes genom att utsöndra lösliga faktorer 13. I flera modeller tumör mus har omogna myeloidceller (inklusive monocytiska och granulocytiska celler) också visat att migrera från benmärgen till mjälten, där de hämmar antitumörspecifika T-cellsaktivering och proliferation 14. Sålunda kunde minskningen av hematopoietiska celler som observerades i benmärgen har resulterat från antingen en brist i hematopoes och / eller från deras emigration. Denna senare mekanism skulle kunna förklara förekomsten av monocytosis i perifert blod eller observation av förstorade myeloida fraktioner i mjälten. Det är också tänkbart att dessa celler kan ha härletts från förbättrad mjälten blodbildningen. Faktiskt, under stationära betingelser, var några undergrupper av mjält-B-celler som prekursorer av mogna B-lymfocyter 15. Inom ramen inflammatoriska tillstånd, Medullary stam- och progenitorceller har visat att flytta till mjälten för att inducera produktionen av mogna monocyter 16. Detta protokoll tillåter oss inte att dra slutsatser om de mekanismer som är involverade i utvecklingen av leukemi, och ytterligare funktionella samt molekylära analyser bör användas för att göra det. Dessa uppgifter omfattar detaljerad information om de kliniska särdragen i akut myelomonocytär leukemi och hjälper forskare att utvärdera och förstå effekterna av nya läkemedel.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the “Ligue Nationale contre le Cancer” (Comité du Septentrion), the SIRIC ONCOLille (Grant INCa-DGOS-INSERM 6041) and the Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille (IRCL) for supporting this work. They would like to thank Delphine Taillieu and the animal facility staff for housing the mice and maintaining their welfare. We also thank Raphaëlle Caillerez and Nathalie Jouy for their respective help in microscopy and flow cytometry.
C1498 cell line | ATCC | TIB 49 | |
C57BL/6J-Ly5.1 | Charles River | B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl | |
Cells culture reagents | |||
2-Mercaptoethanol, Gibco | ThermoFisher Scientific | 21985 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10270 | |
HEPES, Gibco (1 M) | ThermoFisher Scientific | 15630 | |
Non-Essential Amino Acids Solution, Gibco | ThermoFisher Scientific | 11140 | |
Penicillin-Streptomycin, Gibco | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
RPMI 1640 Medium (Gibco, GlutaMAX Supplement) | ThermoFisher Scientific | 61870 | |
Sodium Pyruvate, Gibco (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360 | |
Flow cytometry staining reagents | |||
anti-mouse B220 APC (1) | ebiosciences | 17-0452 | clone RA3-6B2, final dilution 1/100 |
anti-mouse B220 biotin (2) | ebiosciences | 13-0452 | clone RA3-6B2, 1/400 |
anti-mouse CD3 eFluor450 (1) | ebiosciences | 48-0032 | clone 17A2, 1/100 |
anti-mouse CD3 PE (2) | BD biosciences | 555275 | clone 17A2, 1/100 |
anti-mouse CD3 PE-Cy5 (3) | ebiosciences | 15-0031 | clone 145-2C11, 1/100 |
anti-mouse CD4 APC (1) | ebiosciences | 17-0041 | clone GK1.5, 1/500 |
anti-mouse CD4 PE (2) | ebiosciences | 12-0041 | clone GK1.5, 1/200 |
anti-mouse CD8 biotin (1) | ebiosciences | 13-0081 | clone 53-6.7, 1/100 |
anti-mouse CD8 eFluor450 (2) | ebiosciences | 48-0081 | clone 53-6.7, 1/500 |
anti-mouse CD11a biotin | ebiosciences | 13-0111 | clone M17/4, 1/100 |
anti-mouse CD11b PE | ebiosciences | 12-0112 | clone M1/70, 1/200 |
anti-mouse CD16/32 biotin | ebiosciences | 13-0161 | clone 93, 1/400 |
purified anti-mouse CD16/32 (FcR blocking) | BD biosciences | 553141 | clone 2.4G2 |
anti-mouse CD18 biotin (1) | ebiosciences | 13-0181 | clone M18/2, 1/100 |
anti-mouse CD18 FITC (2) | ebiosciences | 11-0181 | clone M18/2, 1/50 |
anti-mouse CD19 PE | ebiosciences | 12-0193 | clone 1D3, 1/200 |
anti-mouse CD21/35 PE | ebiosciences | 12-0211 | clone 8D9, 1/50 |
anti-mouse CD31 PE | ebiosciences | 12-0311 | clone 390, 1/100 |
anti-mouse CD34 eFluor660 | ebiosciences | 50-0341 | clone RAM34, 1/20 |
anti-mouse CD44 PE | BD biosciences | 553134 | clone IM7, 1/50 |
anti-mouse CD45.2 FITC | ebiosciences | 11-0454 | clone 104, 1/100 |
anti-mouse CD49b/Pan NK PE | BD biosciences | 553858 | clone DX5, 1/50 |
anti-mouse CD80 biotin | ebiosciences | 13-0801 | clone 16-10A1, 1/200 |
anti-mouse CD86 biotin | ebiosciences | 13-0862 | clone GL1, 1/200 |
anti-mouse CD107b (Mac-3) PE | ebiosciences | 12-5989 | clone M3/84, 1/40 |
anti-mouse CD115 PE | ebiosciences | 12-1152 | clone AFS98, 1/100 |
anti-mouse CD117 eFluor450 | ebiosciences | 48-1171 | clone 2B8, 1/100 |
anti-mouse CD127 PE | ebiosciences | 12-1271 | clone A7R34, 1/100 |
anti-mouse CD150 APC | ebiosciences | 17-1501 | clone 9D1, 1/20 |
anti-mouse CD274 (PD-L1) biotin | ebiosciences | 13-5982 | clone MIH5, 1/200 |
anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE | ebiosciences | 12-5981 | clone D7, 1/100 |
anti-mouse Ly-6C APC | ebiosciences | 17-5932 | clone HK1.4, 1/200 |
anti-mouse Ly-6G (Gr-1) biotin (1) | ebiosciences | 13-5931 | clone RB6-8C5, 1/400 |
anti-mouse Ly-6G FITC (2) | ebiosciences | 11-9668 | clone 1A8, 1/50 |
anti-mouse MHC class I (H-2Db) biotin | ebiosciences | 13-5999 | clone 28-14-8, 1/50 |
anti-mouse MHC class II (I-A/I-E) PE-Cy5 | ebiosciences | 15-5321 | clone M5/114.15.2, 1/1000 |
anti-mouse NK1.1 PE | BD biosciences | 557391 | clone PK136, 1/50 |
anti-mouse TCRVb FITC | BD biosciences | 553170 | clone H57-597, 1/50 |
streptavidin PE-Cy5 | ebiosciences | 15-4317 | 1/200 |
Immunofluorescence staining reagents | |||
Anti-mouse myeloperoxidase (heavy chain antibody) | Santa Cruz Biotechnology | sc-16129 | 1/10 (20 µg/ml) |
anti-goat IgG (Texas Red coupled antibody) | Jackson Immunoresearch | 705-076-147 | 1/250 |
Normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | |
Hoechst solution | BD Biosciences | 561908 | 1/1000 |
Mounting medium 1 (Fluoromount) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
Acetone | VWR | 20066 | |
Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
Esterase cytochemical staining reagents | |||
Naphtol AS-D chloroacetate solution | Sigma-Aldrich | 911 | |
Dye solution (Fast Red Violet LB Base solution) | Sigma-Aldrich | 912 | |
pH6.3 buffer concentrate (TRIZMAL) | Sigma-Aldrich | 913 | |
Sodium nitrite solution | Sigma-Aldrich | 914 | |
Citrate solution | Sigma-Aldrich | 915 | |
Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GHS3 | |
Acetone | VWR | 20066 | |
Formaldehyde solution, 37% | Sigma-Aldrich | F1635 | |
α-naphthyl butyrate solution | Sigma-Aldrich | 1801 | |
Phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 1805 | |
Sodium nitrite Tablet | Sigma-Aldrich | 1809 | |
Pararosaniline solution | Sigma-Aldrich | 1804 | |
Methylene blue solution | Sigma-Aldrich | 1808 | 1/10 |
mounting medium 2 (Clearmount) | Invitrogen | 00-8010 | |
May-Grünwald Giemsa staining reagents | |||
May-Grünwald solution | RAL Diagnostics | 320070 | |
Giemsa R solution | RAL Diagnostics | 320310 | 1/20 |
pH 6.8 buffer solution | RAL Diagnostics | 330368 | |
Others materials, reagents and equipment | |||
Ketamine 1000 (100 mg/mL) | VIRBAC | 3597132111010 | |
Xylazine SEDAXYLAN (20 mg/mL) | CEVA | ||
Bovin albumin serum (BSA) powder | ThermoFisher Scientific | BP671 | |
PBS solution (1x concentrate) | ThermoFisher Scientific | 14190 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
Ultra Pure 0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575 | |
Separating solution (Pancoll Mouse) | PANBIOTECH | P04-64100 | |
Lysis buffer (Red Blood Cells Lysing Buffer) (10X) | BD Biosciences | 555899 | 1/10 |
NaOH 10N | ThermoFisher Scientific | SS267 | |
Trypan blue solution (0.4 %) | ThermoFisher Scientific | 15250-061 | 1/2 |
50 mL tube (Falcon) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
70µm Cell Strainer (Falcon) | Corning Life Sciences | 352350 | |
Chamber & filter card (EZ Cytofunnel Shandon) | Thermo Scientific | A78710003 | |
Microscope Cover Glasses, 24x24mm | Knittel Glass | VD1 2424 Y100 | |
Slides (Starfrost – ground edges 90) | Knittel Glass | VS1137# 077FKB | |
EDTA Tube | Greiner Bio-One | 454034 | |
Pasteur Pipette 150MM (capillary tube) | Fisherbrand | 1154-6963 | |
26G needle | Terumo | NN-2613R | |
insulin syringe and needle 29G | Terumo | BS05M2913 | |
30G needle | Becton & Dickinson | 304000 | |
Flow cytometry tubes (blue) | Beckman Coulter | 2523749 | |
Water-repellent pen (Dakopen) | Dako | S200230 | |
Sharp sterile scissors | Nessi-care | SCI-01 | |
Sterile forceps | Dominique Dutscher | 956506 | |
Thoma cell counting chamber | VWR | 631-0397 | |
Petri Dishes (Fisherbrand Plastic) | ThermoFisher Scientific | S33580A | |
Microcentrifuge tube (1.5 mL) | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
Cylindrical Restrainer 15-30 gm | Stoelting | 51338 | |
Shandon Cytospin 3 Cytocentrifuge | ThermoFisher Scientific | ||
10 mL syringe | Terumo | SS-10L | |
1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
Ethanol | Merck | 1.08543 | |
Sterile gauze sponges | URGO | 501580 |