פרוטוקול מפורט לאפיון לקו הסלולרי Murine C1498 דגם Associated לוקמיה העכבר שלה
Summary
כתב יד זה מספק הליך טכני, שניתן להשתמש בהם כדי לאפיין בתרביות תאים C1498 במבחנה ואת לוקמיה חריפה הנגרמת בעכברים לאחר ההזרקה שלהם. פנוטיפי ניתוחים תפקודיים מבוצעים באמצעות זרימה cytometry, מיקרוסקופיה immunofluorescence, cytochemistry ומאי-גרונוולד מכתים Giemsa.
Abstract
הזרקה של תאים C1498 לעכברים syngeneic או congenic שבוצעה מאז 1941. זריקות אלו לגרום להתפתחות של לוקמיה חריפה. עם זאת, אופי המחלה הזאת לא תועד היטב בספרות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול טכני לאפיון תאי C1498 במבחנה לקביעת האופי לוקמיה מושרה in vivo. החלק הראשון של הליך זה מתמקד בקביעת שושלת hematopoietic והן שלב התמיינות של תאים בתרבית C1498. כדי להשיג זאת, מכתים תזרים cytometric רב פרמטריים משמש לזיהוי סמנים תא hematopoietic. מיקרוסקופיה immunofluorescence, cytochemistry וכן מכתים מאי-גרונוולד Giemsa מבוצעות ואז להעריך את הביטוי של myeloperoxidase, הפעילות של esterases ומורפולוגיה הסלולר, בהתאמה. החלק השני של פרוטוקול זה מוקדש לתיאור המחלה לוקמיה מושרהvivo. זו האחרונה יכולה להיות מושגת על ידי קביעת התדרים של תאי leukemic הטבועים בדם, איברי hematopoietic (למשל, מח עצם וטחול) ורקמות שאינן הלימפה (למשל, הכבד וריאות) באמצעות מכתים ספציפי cytometry זרימת מנתח. טבעו של לוקמיה הוא אישר מכן באמצעות מאי-גרונוולד Giemsa מכתים מכתים עבור esterases ספציפיים במח העצם. כאן, אנו מציגים את התוצאות שהושגו באמצעות פרוטוקול זה לפי גילאים C1498- ועכברים PBS מוזרק.
Introduction
לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) מאופיין בריבוי בלתי מבוקרת של תאים מיאלואידית hematopoietic הנחסמים בשלבים שונים של הבשלה. חוסר ויסות זה יכול להשפיע על granulocytic, monocytic, האריתרוציטים או מסלולי בידול megaryocytic 1. תאים AML מצטברים במוח העצם, מה שמוביל hematopoiesis פגום, שתוצאתה thrombopenia, lymphopenia ואנמיה. התאים leukemic גם לפלוש דם ואיברים שאינם הלימפה.
מודל העכבר C1498 שימש במשך עשרות שנים כמודל לוקמיה חריפה מאז תאים סרטניים בודדו עכברה 10 בן חודש leukemic C57BL / 6 (H-2 ב) בשנת 1941. הספרות מתארת את הפלישה אל הדם , איברי hematopoietic (למשל, בלוטות הטחול הלימפה) ואיברים שאינם hematopoietic (למשל, הכבד, ריאות, שחלות, וכליות) על ידי תאי שגשוג C1498 מאוד אחרי שהם הוזרקו דרך בtravenous, תת עורית או מסלול תוך הצפק לעכברים רגישים 2-4. עם זאת, במודל של עכברים זה נמסר לגרום 2,5 granulocytic או או myelomonocytic 6 לוקמיה. לאחרונה, מחקר שפורסם בשנת 2002 תיאר סוג זה של סרטן כמו לוקמיה של תאים NKT murine 7. לפיכך, ספרות שונה לגבי אופי הקו הסלולרי C1498 זה ואת לוקמיה הקשורים זה גורם בעכברים. סטיות אלה נקראות בעיקר בשל חוסר מפורט ומידע שפורסם עודכן על התאים ומחל leukemic בכלל כי מחקרים רבים בוצעו ב 1950 – של 70.
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לתאר כיצד לאפיין תאים C1498 ולנתח את אופי המחלה leukemic כי הוא המושרה על ידי הזרקה תוך ורידית שלהם לעכברים. החלק הראשון של פרוטוקול זה מוקדש לתיאור תאי C1498 כי כבר מתורבת במבחנה. אנטי פלורסנטהגופים המכוונים נגד משטח וסמני hematopoietic תאיים ששמשו לקביעת הפנוטיפ שלהם באמצעות cytometry זרימה. הנוכחות של myeloperoxidase הוערכה באמצעות מיקרוסקופיה immunofluorescence, בשלב השושלת והבחנה hematopoietic שלהם הוערכו באמצעות cytochemistry להעריך את הפעילות של esterases, ומאי-גרונוולד Giemsa מכתים בוצע. תאי C1498 אז הוזרקו לעכברים, והמחלה לוקמיה החריפה כי הושרה מתוארת בחלק השני של כתב היד הזה. אותן טכניקות ששימשו לקביעת התדרים פנוטיפים של תאים leukemic ו הגלום מח עצם, דם היקפי, הטחול ואיברים שאינם hematopoietic (הכבד והריאות).
פרוטוקול זה הוא מאוד לשחזור, ואת הנתונים המוצגים כאן יסייעו לחוקרים להעריך את ההשפעות של אסטרטגיות טיפוליות חדשות. במודל של עכברים לוקמיה זה כבר נעשה שימוש כדי לבדוק אימונותרפיה מתקרבnd כימותרפיות סרטן שונים תרופות 8,9. יעילותם הוערכה על ידי קביעת האבולוציה של נטל הגידול ושיעורי ההישרדות. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לספק מידע נוסף על החלוקה והמחייה של אוכלוסיות תאי hematopoietic leukemic ואחרות במהלך טיפול.
Protocol
דיור בעלי חיים וכל הפרוצדורות אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית טיפול בבעלי חיים, CEEA.NPDC (no.512012 הסכם), וכל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות הצרפתית והאירופית לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. 1. אפיון במבחנה של הקו הסלולרי C1498 בתרבות במבחנה של תאי C1498 הכן RPMI להשלים (מכון ממוריאל פארק Roswell) 1640 בינוני על ידי הוספת 50 מ"ל של סרום שור העובר (FBS), 5 מ"ל של פניצילין (100 U / ml) -streptomycin (100 מיקרוגרם / מ"ל), 500 μl של 50 מ"מ β-mercaptoethanol , 5 מ"ל של N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-אתאן חומצה sulfonic (HEPES), 5 מ"ל של חומצות אמינו לא חיוניות ו -5 מ"ל של פירובט נתרן ל -500 מ"ל של מדיום RPMI. לגדל את שורת תאי C1498 ב RPMI להשלים. קציר התאים בתרחיף על ידי pipetting, ולהעביר את התאים צינור 50 מ"ל. צנטריפוגה ב XG 350 במשך 10 דקות, ולהסיר את supernatant. הוסף 20 מ"ל של תמיסת מלח פוספט שנאגרו (PBS) (1x) פתרון, צנטריפוגות ב XG 350 במשך 10 דקות, ולהסיר את supernatant. Resuspend התאים 10 מ"ל של חיץ סדרן תא הקרינה הופעל (FACS) (2.5 גרם של אלבומין בסרום שור (BSA) אבקת ו -2 מ"ל של 0.5 M חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) פתרון 500 מ"ל של תמיסת PBS). ספירת התאים באמצעות תא תומת ספירה קאמרית לאחר מכתים את התאים עם trypan הכחול. אפיון פנוטיפי של הקו הסלולרי C1498 באמצעות immunostaining וזרימה ניתוח cytometry תא שטח מכתים כן חיץ FACS. התאם את התאים שנקטפו במאגר FACS 10 7 תאים / מ"ל ו לוותר 10 6 תאים (100 μl) עבור כל ניסוי מכתים לתוך זרימת cytometry צינורות. לייבל את התאים עם 100 μl של נוגדנים הבאים או בקרות אלוטיפ הקשורים בהם מדולל במאגר FACS: טופסarkers של מבשר תאים מובחנים, לתייג את התאים עם אנטי CD11b / אנטי CD18 (1), אנטי-Ly-6G (1), אנטי CD19, אנטי-B220 (2), אנטי-NK1.1, אנטי CD49b, אנטי CD4 (1), אנטי CD8 (2), אנטי CD3 (3), אנטי-CD21 / 35, אנטי-CD115 ואנטי TCRVβ נוגדנים. עבור סמנים בתאי גזע / אבות היווצרות הדם, משתמשים בשילוב של אנטי CD34 / אנטי-CD117 / אנטי SCA-1, אנטי-CD150 / אנטי-CD117 / אנטי SCA-1, אנטי-CD117 / אנטי-CD127 או אנטי CD16 / 32 ביוטין נוגדנים לבד. עבור סמנים של התא פונקציות (למשל, הדבקה, מצגת אנטיגן, מולקולות גירוי שיתוף קולטנים), להכתים את התאים עם אנטי CD18 (2) / אנטי CD11a, אני בכיתה אנטי MHC, אנטי-MHC class II, אנטי CD31, אנטי CD44, אנטי CD80 ביוטין, אנטי CD86, ואנטי-CD274 נוגדנים. דגירה כל הזרימה cytometry צינורות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שוטפים את התאים פעמיים על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ FACS על צינור אחד, צנטריפוגות ב XG 350 במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant. </li> הוספת 100 μl של חיץ FACS על צינור אחד והמשך מכתים המשני על ידי הוספת 100 μl של streptavidin ניאון (1/100 במאגר FACS עבור דילול הסופי של 1/200) אל נוגדנים biotinylated מצומדות. דגירת הצינורות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. פעמיים לשטוף את התאים כדלקמן: להוסיף 2 מ"ל של חיץ FACS על צינור אחד, צנטריפוגה צינורות ב XG 350 במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant ידי pipetting. Resuspend התאים 500 μl של PBS קר ומניחים את התאים על הקרח, שמירה על אותם בחושך באמצעות רדיד אלומיניום לכיסוי צינורות. נתחו את התוצאות באמצעות cytometer 10. מכתים תאיים הכן חיץ קיבעון על ידי הוספת 125 מ"ל של פתרון paraformaldehyde 4% (PFA) ל 375 מ"ל של תמיסת PBS. הערה: כדי להכין 500 מ"ל של 4% PFA, חום 400 מ"ל של תמיסת PBS כ 60 ° C על צלחת ומערבבים במנדף מאוורר. הוסף 20 גר 'אבקת PFA, ולהעלות את רמת החומציותעד PFA נמס. אפשר פתרון להתקרר, להתאים את ה- pH ל 6.9, ולעשות את הווליום עד 500 מ"ל עם PBS. הכן את החיץ permeabilizing ידי הוספת 0.5 גרם של saponin ו -0.5 גרם של BSA 500 מ"ל של תמיסת PBS. התאם את התאים שנקטפו במאגר FACS 10 7 תאים / מ"ל ולהפיץ 10 6 של תאים (100 μl) עבור כל ניסוי מכתים לתוך זרימת cytometry צינורות. צנטריפוגה התאים ב XG 350 במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant. תקן את התאים ב 200 μl של פתרון 1% PFA דגירה במשך 10 דקות ב 4 ° C. הוסף 2 מ"ל של חיץ permeabilizing על צינור אחד, צנטריפוגה צינורות ב XG 350 במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant ידי pipetting. הוספת 100 μl של חיץ permeabilizing על צינור אחד. לייבל את התאים עם 100 μl של נוגדנים הבאים או בקרות אלוטיפ המתאימים לאחר דילול אותם permeabilizing חיץ: אנטי CD3 (2) / אנטי CD8 (1), אנטי CD3 (3) / aNTI-CD4 (2), אנטי-CD107b ואנטי-CD3 (3) / אנטי TCRVβ. דגירת התאים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. פעמיים לשטוף את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ permeabilizing על צינור אחד. בצנטריפוגה צינורות ב XG 350 במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant. הוספת 100 μl של חיץ permeabilizing אל התאים. המשך מכתים המשני על ידי הוספת 100 μl של streptavidin פלורסנט מדולל permeabilizing חיץ נוגדנים biotinylated מצומדות. דגירת הצינורות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הוסף 2 מ"ל של חיץ permeabilizing על צינור אחד, בצנטריפוגה צינורות ב XG 350 במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant. חזור על פעולה זו עוד פעם אחת. Resuspend התאים 500 μl של קר PBS, ולאחר מכן למקם את התאים על הקרח בחושך. לנתח את התוצאות באמצעות cytometer זרימה 10. הכנת ההשעיה תא בשקופיות למיקרוסקופיה שטפי 10 -6 דונםrvested C1498 תאים (שהושגו בשלב 1.1.4) עם 5 מ"ל של FACS קר חיץ פעמיים, לדלל את התאים ב 1 מ"ל של חיץ FACS קר. מניחים את הצינורות על הקרח. מניחים שקופיות לתוך תאי הפנויה עם כרטיסי מסנן מראש מצ"ב במקום אלה לתוך cytocentrifuge. הוספת 100 μl של חיץ FACS לכל קלף קאמרי המסנן, ומסובב אותם 2 דקות ב g 4.52 x. הוספת 100 μl של תאים לכל קלף קאמרי לסנן, לסובב את התאים ב 4.52 XG למשך 2 דקות. מוציאים בזהירות את השקופיות מתאי ואוויר-לייבש את השקופיות לפני השארתם myeloperoxidase (שלב 1.4), esterases (שלב 1.5) או מאי-גרונוולד Giemsa (שלב 1.6). מכתים Myeloperoxidase עבור immunofluorescence תקן את התאים בשקופיות ידי טבילת השקופיות מתנול קרה: אצטון (1: 1) פתרון עבור 2 דקות, ולאחר מכן להתייבש באוויר השקופיות. כדי להגביל את הנוזל לאזור של השקופית המכילה את התאים, לצייר CIrcle סביב התאים באמצעות עט דוחה מים. שוטף את תאי 200 μl של פתרון קר PBS במשך 10 דקות. חסום את התאים 200 μl של 3% BSA / PBS חיץ המכיל 10 μl של חמור בדם נורמלי ו -10 מיקרוגרם / מ"ל של מטוהרים אנטי CD16 / 32 נוגדנים. החל 200 μl של myeloperoxidase אנטי עכבר (מדולל ל 20 מיקרוגרם / מ"ל ב חיץ 3% BSA / PBS). דגירת התאים O / N ב 4 מעלות צלזיוס בתא לחות. שוטפים את התאים עם 200 μl של 0.1% BSA / PBS קר. החל 200 μl של נוגדנים מסוג IgG נגד עז מדולל ב 1/250 ב 3% BSA / PBS חיץ. דגירת התאים למשך שעה 2 ב RT בתא לחות. שוטפים את התאים 3 פעמים עם 200 μl של חיץ 0.1% BSA / PBS ופעמיים בקור PBS. הכתם גרעיני תאים עם 200 μl של Hoechst מדולל ב 1 / 1,000 PBS (לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל) עבור 2 דקות ב RT. שטפו את השקופיות עם מים ולאפשר להם אוויר יבש לפני מאונטיןז. החל טיפה אחת של הרכבה בינונית 1 אל התאים, להציב קצה אחד של זכוכית מכסה לשקופית, ובזהירות ומוריד אותה אל התאים באמצעות מלקחיים. לחץ בעדינות על מכסה הזכוכית כדי להסיר בועות אוויר. אסטראז cytochemistry הערה: טרום חם כל ריאגנטים RT. הכנה מקבעת כדי להכין את הפתרון ציטראט-אצטון-פורמלדהיד (CAF), להוסיף 2.5 מ"ל של תמיסת ציטרט, 6.5 מ"ל של אצטון 0.8 מ"ל של 37% פורמלדהיד בקבוק זכוכית. מערבבים בעדינות ולאחסן על 4 מעלות צלזיוס. Naphthol AS-D אסטראז Chloroacetate assay פעילות (CAE) מים ללא יונים חמים 37 ° C. בתוך צינור 50 מ"ל, להוסיף 1 מ"ל של תמיסת סודיום ניטריט עד 1 מ"ל של תמיסת צבע. מערבבים בעדינות ולתת לעמוד במשך 2 דקות. הוסף 40 מ"ל מים ללא יונים מחומם מראש, 5 מ"ל של תרכיז pH 6.3 חיץ 1 מ"ל של Naphthol AS-D פתרון Chloroacetate. מערבבים ומעבירים לצנצנת Coplin. תקן את התאים עלשקופיות (ראו סעיף 1.3) למשך 30 שניות עם פתרון CAF (ראה שלב 1.5.1.1), ולשטוף את השקופיות עבור 45 שניות עם מים ללא יונים. העברת שקופיות לתוך התמיסה כי היה מוכן בשלב 1.5.2.2, דגירה השקופיות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתא לחות מוגן מפני אור. לייבש את השקופיות ולאחר מכן לשטוף אותם באמצעות טבילה במים deionized במשך 2 דקות. Counterstain את התאים על ידי הוספת כמה טיפות של תמיסת Hematoxylin דוגרים אותם דקות 1. שטפו את השקופיות במים ניטרליים (pH 7) ולאפשר להם אוויר יבש. החל טיפה אחת של הרכבה בינונית 2 לתאים, להציב קצה אחד של זכוכית מכסה לשקופית ובזהירות ומוריד אותה אל התאים באמצעות מלקחיים. לחץ בעדינות על מכסה הזכוכית כדי להסיר בועות אוויר. assay פעילות אלפא-Naphthyl אסטראז בוטיראט (Nbe) פתרון בוטיראט α-naphthyl חם 37 ° C לפני השימוש. לדלל טבליה אחת של ניט נתרןטקס ב 6.25 מ"ל של מים ללא יונים. בתוך צינור 50 מ"ל, להוסיף 1.5 מ"ל של פתרון Tablet סודיום ניטריט ו -1.5 מ"ל של פתרון Pararosaniline. מערבבים בעדינות ולאפשר הפתרון לעמוד במשך 5 דקות. מוסף הפתרון עם 40 מ"ל של תמיסת פוספט שנאגרו. מביאים pH 6 על ידי הוספת בקפידה 10 N NaOH dropwise. הוסף 5 מ"ל של הפתרון בוטיראט α-naphthyl, לערבב את הפתרון כולו, ולהעביר אותו לתוך צנצנת Coplin. תקן את התאים על השקופיות עבור 10 שניות באמצעות פתרון CAF ב RT ולשטוף במשך 45 שניות עם מים ללא יונים. העברה מחליקה לתוך צנצנת Coplin המכילה את הפתרון כי היה מוכן בשלב 1.5.3.2 דגירה יחד עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס בתא לחות תוך מוגן מפני אור. יש לשטוף את השקופיות עבור 2 דקות במים ניטרליים (pH 7) ואוויר יבש. Counterstain את התאים עם פתרון כחול מתילן על ידי הוספת כמה טיפות בשקופית דגירה במשך 4 דקות. לטבול את השקופיות deionized מים למשך 2 דקות ולאפשר להם להתייבש באוויר. כדי לעגן את השקופיות, להחיל טיפה אחת של הרכבה בינונית 2 לתאים, להציב קצה אחד של כיסוי זכוכית לשקופית, ובזהירות ומוריד אותה אל התאים באמצעות מלקחיים. לחץ בעדינות על מכסה הזכוכית כדי להסיר בועות אוויר. מאי-גרונוולד Giemsa (MGG) מכתים כתם התאים (מוכן בסעיף 1.3) על ידי טבילת השקופיות לתוך צנצנת Coplin המכילה פתרון מאי-גרונוולד במשך 3 דקות. העברת שקופיות לתוך צנצנת Coplin המכיל את פתרון חיץ pH 6.8 דקות 1. כתם השקופיות ידי הצבת לתוך צנצנת Coplin המכילה את פתרון R Giemsa (מדולל ל 1/20 בתמיסת pH 6.8 חיץ) במשך 10 דקות. שטפו את השקופיות במים ניטרליים (pH 7) למשך 10 שניות. מסננים ואוויר-לייבש את השקופיות. הר שקופיות על ידי החלת טיפה אחת של הרכבה בינונית 2 על התאים. מניחים בקצה אחד של זכוכית המכסה לשקופית ובזהירות להורידו עלאל התאים באמצעות מלקחיים. לחץ בעדינות על מכסה הזכוכית כדי להסיר בועות אוויר. 2. Vivo פיתוח ואפיון של לוקמיה חריפה הערה: congenic נקבה בת ארבעה שבועות עכברים C57BL / 6J-Ly5.1 נשמרו בתנאים הפתוגן ללא ספציפי (כלומר, בסביבה סטרילית). העכברים הוזרקו כשהיו בין 5 ל -6 שבועות. מתן תוך ורידי עם תאים C1498 קציר תאי C1498 בתרבית השעיות ידי pipetting. מעבירים את התאים צינור צנטריפוגות 50 מ"ל ב 350 XG במשך 10 דקות. שוטפים את התאים ב 10 מ"ל של קר PBS פעמיים, ולהכין ההשעיה תא 10 מ"ל 7 תאים / PBS. מניחים את ההשעיה הסלולר על הקרח לפני ביצוע ההזרקה. מניחים את העכבר בתוך עוצר ולבצע הזריקה בתנאים סטריליים במנדף זרימה למינרית. שימוש במחט 29G עם מזרק כדי להזריק את התאים לתוךוריד הזנב. אחוז הזנב בקצה הדיסטלי, ולחטא אותו עם ספוג גזה טבול אתנול 70%. בדוק כדי לוודא שאין בועות אוויר בתוך המזרק, ואז לאט לאט להזריק 100 μl של השעית תא C1498 (10 6 תאים) לתוך וריד הזנב. לאחר הזריקה, להוציא את המחט מזנב, ולשלוט בכל הדימום על ידי הפעלת לחץ בעזרת ספוג גזה סטרילי באזור הזריקה. מחזירים את החיה לכלוב שלה, ולבדוק הבריאות שלה בזהירות מעל בשעות ובימים הבאים. איסוף דם רטרו מסלולית מעקב אחר ההתנהגות של עכברים שהוזרק C1498 PBS- ו סימנים של המחלה leukemic (למשל, piloerection, בידוד מהקבוצה, והקטינו או לא תנועות בכלוב). הערה: זו מתרחשת בדרך כלל בין 17 עד 19 ימים לאחר התאים מוזרקים. בצע רטרו איסוף דם מסלולית רק לפני המתת חסד (ראה שלב 2.2.7) בתנאים סטריליים זרימה למינריתמכסה מנוע תחת מנורת חימום כדי למנוע היפותרמיה. עבור הרדמה, להשתמש קטמין ב 150 מ"ג / ק"ג ו xylazine ב 10 מ"ג / ק"ג. הכן את ההרדמה על ידי דילול 1.5 מ"ל של קטמין ו 0.5 מ"ל של xylazine ב 18 מ"ל של תמיסת PBS. להרדים את מלאת עכברי leukemic. המשך עם זריקה intraperitoneal של 200 μl של הפתרון הרדמה לכל 10 גרם של העכבר באמצעות מחט 26G ו מזרק 1 מ"ל. בדוק על אובדן רפלקס הדוושה כדי לאשר הרדמה. הכנס צינור נימים לתוך canthus המדיאלי של העין. דם יעלה מ הסינוס מסלולית לתוך צינור הנימים. להשתלט על הדימום על ידי הפעלת לחץ בעדינות על העין עם ספוג גזה סטרילי. הערה: נפח של 100 עד 200 μl של דם ניתן לאסוף באמצעות טכניקה זו. אסוף את הדם לתוך צינור EDTA, ולאחסן את המדגם על הקרח לפני לבודד את התאים mononuclear. להרדים את העכבר באמצעות פריקה צוואר הרחם, ולהמשיך לבודד את האיברים (סעיף 2.3). בידוד איברים ותאים בידוד איברים מניחים את העכבר מורדמים על הגב שלה על לוח פלסטיק ולהשתמש מחטים להצמיד את הרגליים של החיה כדי להקל בידוד איברים. לחטא את העכבר באמצעות אתנול 70% לפני ביצוע חתך. בעזרת מספרי סטריליות, לבצע חתך גחון מעור הבטן עד הצוואר. חותכים דרך דופן הבטן כדי לגשת הכבד. חותכים דרך כלוב הצלעות הסרעפת לגשת הריאות. הזז את המעי לצד ולהסיר את הטחול באמצעות מספריים מלקחיים סטרילית. כדי לבודד את מח העצם, לחתוך את הרגליים בחלק העליון של עצמות הירך מעל המפרק באמצעות מספריים סטרילית. נתק את השוקה מן הירך על ידי משיכה עדינה, ולהסיר את העור והשרירים מהעצמות באמצעות מלקחיים ומספריים. מניחים כל איבר ועצמות בתוך שפופרת 50 מ"ל המכיל קר PBS, ומניחים אותם על הקרח. בידוד של תאים מהאיברים לשקול את הטחול לפני לשבש את התאים. מבחינה מכנית לשבש את הטחול, הריאות והכבד ידי לחיצה אותם דרך מסננת 70 מיקרומטר באמצעות הבוכנה במזרק בתוך שפופרת 50 מ"ל, לאסוף את התאים לתוך 30 מ"ל של קר PBS. כדי לאסוף תאי מח עצם, לשים את עצמות הירך לבין שוקיים בצלחת פטרי על קרח, לחתוך את הגפיים באמצעות מספריים סטרילי, לשטוף את מוח העצם על ידי החדרת מחט 26G מצורף מזרק 10 מ"ל המכיל 5 מ"ל של קר PBS. לשבש את תאי מח העצם על ידי עובר ההשעיה התא דרך מחט / מזרק, ולסנן את ההשעיה התא דרך מסננת 70 מיקרומטר בתוך שפופרת 50 מ"ל. צנטריפוגה כל צינורות המכילים כל אחד האיברים ואת תאי מח העצם ב XG 350 במשך 10 דקות. בטל supernatant, ו resuspend התאים שנאספו ממח הריאות העצם ב 2 מ"ל של חיץ תמוגה (1x) והתאשעות מבודד מהכבד והטחול ב 5 מ"ל של חיץ תמוגה (1x) על ידי pipetting את התערובת בעדינות מעלה ומטה. ממלאים את צינורות עד 50 מ"ל עם קר PBS. צנטריפוגה התאים ב XG 350 במשך 10 דקות. Resuspend התאים חיץ FACS עבור ניתוח תזרים cytometry או להכין את התאים במיקרוסקופ. ספירת התאים באמצעות תא ספירת תאי תומה לאחר השאיר trypan הכחול. מכתים פני התא של תאים מבודדים מאיברים עבור ניתוח תזרים cytometry בשנת זרימה cytometry צינור, תווית 10 6 תאים שהיו מבודדים מאיברים עם 10 מיקרוגרם / מ"ל של נוגדנים מטוהרים אנטי CD16 / 32 ב 100 μl של חיץ FACS. עד 10 6 תאים במח העצם, להוסיף 100 μl של נוגדנים הבאים או שילובים של נוגדנים ובקרות אלוטיפ המתאימים מדולל במאגר FACS: אנטי CD11b / אנטי CD3 (1) / אנטי Ly6C / אנטי Ly6G (2), אנטי-B220 (1) /anti-CD45.2/anti-CD19, אנטי-CD115 / אנטי CD3 (1) /TI-Ly6C / אנטי Ly6G (2),-CD45.2, אנטי Ly6G (2), אנטי-CD11b, אנטי-CD115 או אנטי CD19 לבד הגדרות פיצוי. כדי splenocytes, להוסיף 100 μl של נוגדנים הבאים ובקרות אלוטיפ המתאימים מדולל במאגר FACS: שילוב של אנטי-CD11b / אנטי CD3 (1) / אנטי Ly6C / אנטי Ly6G (2), אנטי-B220 (1 /anti-CD45.2/anti-CD19, אנטי CD45.2), אנטי-Ly6G (2), אנטי-CD11b או-CD19 אנטי עבור הגדרות פיצוי. כדי לתאי ריאה וכבד, להוסיף 100 μl של נוגדנים נגד CD45.2 ובקרה אלוטיפ המתאים מדולל ב 1/100 במאגר FACS. דגירה כל פתרונות התא למשך 30 דקות ב 4 ° C. שוטפים את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ FACS על צינור אחד. צנטריפוגה צינורות במשך 5 דקות ב 350 XG ולהשאיר את supernatant ידי pipetting. חזור על פעולה זו עוד פעם אחת. Resuspend התאים שכותרתו 500 μl של PBS קר. שמור את התאים על הקרח מוגן מפני אור לפני ביצוע זרימת cytometry עבור acquisition וניתוח 10. בידוד של תאים mononuclear דם מכתים immunofluorescent עבור ניתוח תזרים cytometry לפני שמתחילים בפרוטוקול, מראש לחמם הפתרון הפרדת RT. מעבירים את דגימת דם (100 עד 200 μl; המתקבל צעד 2.2) לתוך צינור microcentrifuge, ולהוסיף פתרון PBS / 1 mM EDTA עד נפח הפתרון הוא 500 μl. בזהירות שכבת 500 μl של הפרדת פתרון תחת תמיסה המכילה את הדם באמצעות מחט 30G ו מזרק 1 מ"ל. אין לערבב את הדם ואת פתרון ההפרדה. צנטריפוגה צינורות ב 800 XG (ללא בלם) במשך 20 דקות ב RT. לאחר צנטריפוגה, לאסוף את טבעת הסלולר (ההשכבה הלבנה האטומה) בעזרת פיפטה. מעבירים את התאים לצינור microcentrifuge. הערה: ההשכבה הלבנה האטום מכילה לימפוציטים וכן מונוציטים ומופיעה בין השכבה התחתונה – פתרון הפרדה – ואת השכבה העליונה. הוסף 1 מ"לשל פתרון PBS, ו צנטריפוגות הצינור ב XG 350 במשך 10 דקות. Resuspend התאים 600 μl של חיץ FACS. הוסף 10 מיקרוגרם / מ"ל של אנטי CD16 / 32 נוגדנים מטוהרים ולהפיץ 100 μl של השעיה התא לתוך שישה צינורות נפרדים (100 μl כל אחד). לייבל את התאים עם 100 μl של נוגדנים הבאים או בקרות אלוטיפ הקשורים בהם מדולל במאגר FACS: שילוב של-CD3 אנטי (1) / אנטי-B220 (1) /anti-CD45.2 ואנטי Ly6C / אנטי-CD115 /anti-CD45.2 או אנטי-CD45.2 ואנטי-CD115 לבד הגדרות פיצוי. דגירה כל הצינורות על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שוטפים את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ FACS על צינור אחד, ואז צנטריפוגות צינורות במשך 10 דקות ב 350 XG, וזורקים supernatant בעזרת פיפטה. Resuspend התאים שכותרתו 500 μl PBS קר. שמור את התאים על קרח מוגן מפני אור לפני ביצוע זרימת cytometry רכישה וניתוח 10. הכנת תרחיפים תא מח עצם בשקופיות למיקרוסקופיה פעל על פי השלבים המתוארים בסעיף 1.3, אבל בשלב 1.3.1, השתמש 10 5 תאים במח העצם, בשלב 1.3.4, לסובב את התאים לתוך כל תא ב 72.26 XG במשך 10 דקות. מבחני פעילות אסטראז באמצעות תאי מח עצם כדי לבצע את מבחני cytochemistry אסטראז מח עצם, להמשיך מן הצעדים 1.5 עד 1.5.3.7. מאי-גרונוולד Giemsa מכתים של תאים במח העצם כדי להכתים תאים במח העצם, לעקוב אחר פרוטוקול כמתואר בסעיף 1.6, אבל בשלב 1.6.1, דגירה את השקופיות פתרון מאי-גרונוולד למשך 5 דקות.
Representative Results
כדי לאפיין את מודל עכבר C1498, המשכנו עם שני שלבים עיקריים. ראשית, תאי C1498 התאפיינו לקבוע בשלב השושלת והתבגרות hematopoietic שלהם במבחנה (איור 1). תאים אלה הוזרקו אז לעכברים congenic, ואופי המחלה leukemic המושרה הוערך לקבוע תכונות שונות: חדירת תא leukemic, פנוטיפ שלהם, כימות של תאים hematopoietic (בוגרת אבות / מבשרי) במח העצם, התדרים של C1498 תאים ותאי hematopoietic בוגרים בדם והערכת נפיחות איבר (בטחול, בכבד, וריאות) ואת רכב הסלולר. כדי לאפיין את פנוטיפים תא C1498 במבחנה, התאים תויגו עם נוגדנים המכוונים נגד מולקולות אשר מתבטאים על ידי מבשרי hematopoietic ותאי בוגרת (טבלה 1), ואת התוצאות נותחו באמצעות זרימת cytometר"י. תאי C1498 היו חיוביים עבור ביטוי פני תא של Mac-1 (CD11b / CD18) (~ 7%), B220 (> 25%), והם מוצגים ביטוי תאי של CD3ε, קולטן T-Cell (TCR) שרשרות Vβ ו- Mac -3 (איורים 2A ו- B). התאים היו שליליות על שטח פני התא סמנים Ly6G, Ly6C, CD115, CD21 / CD35, CD19, CD3, CD4, CD8, NK1.1, והפאן-NK מולקולות על מנת לתת ביטוי תאיים של CD4 ו CD8 (מידע לא מוצג) . הם נבדקו אז עבור סמנים של תאי גזע hematopoietic ואת אבות (טבלה 1). הם היו גם שליליים לביטוי פני תא של CD117, CD34, SCA-1, CD150 ו CD16 / 32 (מידע לא מוצג). תאים leukemic אלו נבדקו מכן כדי לקבוע את הביטוי של הידבקות, מצגת אנטיגן ומולקולות גירוי שיתוף. התאים הביע סמנים משטח LFA-1 (CD11a / CD18), CD44, CD31 (PECAM-1), ו- H-2 ד ב ו היו שליליות עבור הכיתה MHC II, CD80, CD86 ו CD274 (מידע לא מוצג). t תאי C1498herefore לידי ביטוי הן מיאלואידית (Mac-1, Mac-3) וסמנים הלימפה (B220, CD3, TCR). כדי להיטיב לאפיין השושלת שלהם hematopoietic, ביטוי myeloperoxidase הוערך באמצעות מיקרוסקופיה immunofluorescence. כל התאים היו חיוביות עבור myeloperoxidase, אשר אומת המוצא מיאלואידית שלהם (איור 3 א). רוב התאים גם מוכתם חיובית esterases בוטיראט α-naphthyl (איור 3B, בחלונית הימנית), וחלק מהם מוכתם עבור naphthol AS-D esterases chloroacetate (חיצים שחורים) (איור 3B, פאנל מימין). תוצאות המחקר מראות כי התאים הכילו תערובת של תאי monocytic ו granulocytic. לאחר מאי-גרונוולד Giemsa מכתים בוצע, התאים C1498 נצפו להציג מורפולוגיה הפיצוץ דמוי עם יחס גבוה Nucleo-cytoplasmic, 3 עד 5 nucleoli בגרעין, הילה perinuclear, vacuoles רבים וכן הציטופלסמה basophilic (איור 3 ג ). thלנו, הקו הסלולרי C1498 מורכב monoblasts ו myeloblasts. התאים C1498 (CD45.2 +) אז היו מוזרק לווריד לתוך CD45.1 + עכברים. העכברים נכנעו 17 עד 19 ימים לאחר התאים הוזרקו. עכברים אלו הוקרבו כך הסוג לוקמיה שלהם יכול להיות מנותח לפני שהם מתו מהמחלה. העכברים המלאים, אשר הוזרקו PBS, נותחו באותו מועדים לפי שעון להשוואה. C1498 תא מוזרק עכברים מוצג חדירה מסיבית של תאים C1498 לתוך מח העצם שלהם, כפי שהוכח על ידי הופעתו הפיצוץ דמוי של תאים לאחר מכתים מאי-גרונוולד Giemsa בוצע (איור 4 א). הם גם נשמרים monocytic שלהם פנוטיפים granulocytic (איור 4 ב ו-ג), הוכחת הצטברות של תאי monoblastic ואת מוח העצם האופייני של לוקמיה חריפה myelomonocytic. כדי דetermine אם מספרי תאי hematopoietic מדולרי היו נמוכים לאחר פלישת תאי leukemic, CD45.2 + C1498 תאים, לימפוציטית B, monocytic ואוכלוסיות granulocytic (כולל אבות, מבשרים ותאי מבוגר) כומתו באמצעות מכתים immunofluorescent ותזרים רב פרמטריים ניתוח cytometry. תאי leukemic מיוצגים 16 ל -36% של תאי hematopoietic (מידע לא מוצג). סוגי התאים האחרים היו כל נוכחים במספרים נמוכים משמעותי בעכברים המוזרקים C1498 מאשר העכברים המוזרקים PBS (על ידי פי 5 בממוצע תת תא B, פי 4 בממוצע עבור תאי granulocytic ו פי 3 בממוצע עבור תת monocytic) (איור 5 א ג). מבדיקה של התדרים של תאי mononuclear בדגימות דם leukemic ושליטת עכבר הראתה כי הם מכילים אחוז דומה של לימפוציטים (איור 6 א), אלא בתדירות גבוהה יותר של monocytic ותאי leukemic. מאפיינים אלה הם נציג של לוקמיה חריפה myelomonocytic 11 (איור 6). בין התכונות האחרות של לוקמיה החריפה myelomonocytic 12, העכברים המוזרקים C1498 מוצגים עם כבדי נפוחות (hepatomegaly), ריאות טחול (splenomegaly) (איור 7 א). תדרים שונים של תאים CD45.2 + C1498 אותרו באיברים אלה באמצעות מכתים immunofluorescent ו cytometry ניתוח תזרים (איור 7). כפי splenomegaly יכול לנבוע מספרים גבוהים של מונוציטים הסתננו, אנחנו גם הערכנו את הפרופורציות של אוכלוסיות טחול. המספרים של תאים לימפוציטית B, monocytic ושברי תא granulocytic היו גדולים יותר משמעותי, בשיעור ממוצע של פי 2, פי 2.5 ו 3-לקפל, בהתאמה, ב spleens leukemic מאשר טחול ביקורת (איור 7C). <p class="jove_content" fo:keep-together.wi דק-page = "1"> ייצוג סכמטי באיור 1. לפרוטוקול הגדרה לאפיון שורות תאים במבחנה המתורבת C1498 וב תיאורי vivo של לוקמיה החריפה. שושלת hematopoietic ושלב ההתמיינות של תאי C1498-מתורבת רקמות נקבע ראשון. תאים C1498 הוזרקו לעכברים אז congenic לגרום להתפתחות של לוקמיה חריפה. בידודו של מח עצם, דם היקפי, טחול, כבד ורקמות ריאה בוצע על מנת לקבוע את התדרים, פנוטיפים שינויים מורפולוגיים לאחר חדירת תאי C1498. IV: MGG תוך ורידי:. מאי-גרונוולד Giemsa אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. המודעה / 54,270 / 54270fig2.jpg "/> איור 2. פנוטיפי ניתוח של C1498 תאים לאחר במבחנת תרבות. תזרים נציג cytometry מגרש נקודה היסטוגרמות של פני תא (א) ו התאי (B) C1498-הביע מולקולות שהיו קשורים עם התמיינות תאי בוגרי hematopoietic מוצגות. תאי C1498 נבצרו מתרבויות, שטף ומסומן באמצעות נוגדני ניאון שהיו ספציפיים פני התא CD11b, CD18 וסמני B220 או בקרות אלוטיפ שלהם. עבור מכתים תאיים, התאים היו קבועים, permeabilized ומסומן באמצעות נוגדנים המכוונים נגד Mac-3, CD3ε, וכן epitope המשותף של TCR (T-Cell Receptor) שרשרת Vβ או בקרות אלוטיפ שלהם. ניתוחים בוצעו באמצעות gating עם תאים חיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. ntent "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 3. פונקציונלי מורפולוגי אפיון תאים בתרבית C1498. תאים C1498 נבצרו מתרבויות centrifuged על שקופיות מיקרוסקופ. (א) מכתים לביטוי myeloperoxidase בוצעה באמצעות immunofluorescence. (ב) תגובות Cytochemical שימשו לנתח את אסטראז בוטיראט α-naphthyl (Nbe) ו naphthol AS-D אסטראז chloroacetate (CAE) פעילויות בתאי C1498. תאים נחשבו חיובי עבור כל תווית כאשר חום ואדום-סגולים, גרגירים ציטופלסמית גדולים, בהתאמה, נצפו. (C) מאי-גרונוולד Giemsa (MGG) מכתים של C1498 תאים. עבור כל ניסוי מכתים, הגדלת מטרת מיקרוסקופיה מותווה. כל תמונה מייצגת של שלושה ניסויים נפרדים.large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4. מח עצם מורפולוגיות ב PBS- ו C1498-מוזרק עכברים. תאי מח עצם בודדו PBS- ועכברים C1498-מוזרק תא centrifuged על שקופיות עבור מיקרוסקופיה. (א), רשאי-גרונוולד Giemsa (MGG) מכתים. (B אסטראז בוטיראט α-naphthyl) (Nbe) ו- (ג) naphthol AS-D אסטראז chloroacetate (CAE פונקציות) הוערכו באמצעות cytochemistry. בפנל, הלהקה (בוסר) או בפילוח שונה (בוגרים) נויטרופילים הם פחות גלויה במח העצם של העכברים המוזרקים C1498 מאשר העכברים המוזרקים PBS. לוח B ו- C עולה כי חלה הצטברות של תאי monocytic ו granulocytic במח העצם leukemic לעומת המספרים שנצפתה במח העצם שליטה. את כלניתוחים מיקרוסקופים בוצעו באמצעות מטרה בהגדלת 100x. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 5. ניתוח כמותי של מדולרי אוכלוסיות ב PBS- ו C1498-מוזרק עכברים. תאי מח עצם בודדו PBS- ו C1498 עכברים מוזרק תא והעריך לאחר ספירת תאים בוצעה. התדרים של אוכלוסיות התאים השונות נקבעו לאחר immunostaining ותזרים מגודר תא חי cytometry ניתוח. (א) תת תא B כלל CD19 + B220 + תאים בשלבים מתאים-B Pro להבשיל לימפוציטים מסוג B (B) תאי granulocytic ב CD3 – ו CD11b + Ly6G + שושלות, שכלל מבשרי. nd גרנולוציטים בשלה ובוגרת (ג) תת monocytic הוגדר CD3 – CD115 + וכלל תאים ובתאים להבשיל בשלבים מונוציטים. n = 7 עכברים / קבוצה, והנתונים מוצגים היסטוגרמות מראות את אמצעי ± SEM. *** P <0.0001 ו **, p <0.01, מבחן T- של סטודנטים מזווגים השוואת PBS- ועכברי C1498-מוזרקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. בדיקות דם איור 6. של תת תא mononuclear ב PBS- ו C1498-מוזרקות עכברים. תזרים נציג cytometry מגרשים נקודה של (א) T ו- B אחוזי הלימפוציטים, אשר הוגדרו בהתאמה כמו CD3 + ו- B220 + התאים PBS- ו C1498 תא מוזרק. עכברים (B) תא תדרי monocytic ב C1498 leukemic ובקרה (PBS) עכברים נקבעו על ידי ניתוח CD115 + Ly6C – ו CD115 + Ly6C תאים גבוהים. הניתוח בוצע על ידי gating תאים חיים. כדי להשוות עכברים leukemic ובקרה, CD45.2 + C1498 תאים לא נכללו במחקר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. הערכת איור 7. אוכלוסיות הטחול ב leukemic ובקרה עכברים. (א) תמונות נציג של הכבד, הריאות והטחול נפיחות בעכברים leukemic לעומת שליטה עכברים. טחול נאסף שקל, splenocytes נספר בא שיבוש רקמות. (ב) היסטוגרמה מייצג תדרים סלולריים leukemic ב different איברים לאחר immunostaining בוצע עבור CD45.2 + תאים והתוצאות נותחו באמצעות cytometry הזרימה. (C) אומדנים B הטחול, granulocytic ומספרי טלפונים monocytic לאחר immunostaining וזרימה cytometry gating ניתוח בוצעו לזהות CD19 + B220 חי + , CD3 – CD11b + Ly6G +, CD3 – CD11b + Ly6C – ו CD3 – CD11b + Ly6C תאים גבוה. ברי המידה לראות את הריאות, הטחול וכבד עולים 1 סנטימטר. .. n = 5 – 8 עכברים / קבוצה, והנתונים מיוצגים היסטוגרמות כאמצעי ± SEM *, p <0.05; **, p = 0.0033, מבחן T- של הסטודנטים מזווג השוואת PBS- ועכברים C1498-מוזרק אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <tbody> סוג התא ממברנה או מולקולות תאיות מבשרים ותאים למבוגרים תאי NK NK1.1 +, פאן-NK + תאי NKT NK1.1 +, פאן-NK +, TCR Vbeta + (8.2), CD3 + לימפוציטים מסוג T TCR Vbeta +, CD3 +, CD4 +, CD8 + מבשרי תאי B ו- B לימפוציטים B220 +, CD19 +, CD21 / 35 + מבשרי גרנולוציטים granulocytic Ly6G +, Mac-1 +, CD11b + מבשרי monocytic ומונוציטים / מקרופאגים CD11b +, Mac-1 +, Mac-3 +, CD21 / 35 +, CD115 +, Ly6Chi אבות אבות multipotent CD117 + Sca-1+ CD34 + (Lin- CD150-) אבות multipotent-דרוך הלימפה CD117hi SCA-1hi CD127 + (Lin-) אבות הלימפה משותפים CD117lo SCA-1lo CD127 + (Lin-) אבות מיאלואידית משותפים CD16 / 32lo CD117 + CD34int (Lin- SCA-1-) אבות גרנולוציט-מקרופאג CD16 / 32hi CD117 + CD34hi (Lin- SCA-1-) אבות megakaryocyte-erythroid CD16 / 32lo CD117 + CD34lo (Lin- SCA-1-) תאי גזע hematopoietic CD117 + SCA-1 + CD150 + (Lin- CD34-) טבלה 1. סמנים של שושלות תאים Hematopoietic והבחנה. CD: מקבץ של בידול; לין: סמנים של תאים בוגרים; והנה:ביטוי נמוך; היי: ביטוי גבוה; int: ביטוי הביניים; NK: תאי הרג טבעיים; TCR: קולטן T-cell.
Discussion
במחקרים קודמים, הקו הסלולרי C1498 תואר inducer של granulocytic החריפה 5, myelomonocytic 6 או לוקמיה של תאי NKT 7. עם זאת, נתונים הפגנתיים בספרות היו נעדרים או חלקיים. הפרוטוקול המובא כאן משתמש בטכניקות שונות, כגון cytometry זרימה, immunofluorescence, מכתים MGG מבחני cytochemical, לאפיין תאי C1498 תרבותיים ולקבוע את האופי לוקמיה מושרה בעכברים אחרי שהם מוזרקים.
כשאנחנו phenotyped בתאים C1498 מתורבת במבחנה לאחר immunostaining ותזרים cytometry ניתוחים בוצעו, אנו מקיימים כמה מגבלות, מאחר תאים אלה הביעו כמה סמנים hematopoietic תא השטח כי תוארו בעבר בספרות 6,7. בהסכם עם התוצאות שלנו, Labelle et al. לא שומר את הביטוי על פני קרום התא של TCR בוגר על תאי C1498 באמצעות זרימת cytometמכתים ר"י. עם זאת, הם ראו בהם להיות קו התא NKT אחרי שהם מזוהים CD3ε ו TCRVβ8.2 mRNAs 7. גם ראינו את הביטוי התאי של שרשרות TCRVβ ומולקולות CD3ε במרבית התאים (> 70%), אבל שושלות hematopoietic שלהם לא ניתן לקבוע כי לא היה גם ביטוי תאי קשור של מולקולת Mac-3.
מכתים והערכות Myeloperoxidase, MGG לנתח esterases תפקודית באמצעות cytochemistry הוכיחו כי הקו הסלולרי C1498 היה ממוצא מיאלואידית והורכב של monoblasts ו myeloblasts. תוצאות אלו היו שתואמים את אחוז Mac-3 + התאים התקבלו ניתוח תזרים cytometry מכתים. אמנם לא כמותיים, צעדים אלה מייצגים ניסויי מפתח להתבצע. ואכן, הם נשארים, עד כה, השיטות קיימות הטובות ביותר לאפיון במת שושלת התמיינות של תאי hematopoietic מבטאים לא או f סמנים פנוטיפי ספציפיים EW.
Cytometry זרימה מכתים היה מועיל עבור הוכחת התפתחות לוקמיה חריפה בעכברים congenic לאחר C1498 התאים היו מוזרק לווריד. CD45.2 + C1498 התאים שחדרו לתוך הדם ההיקפי ואיברים שונים היו מבודדים, והתדרים שלהם נקבעו. כימות בוצעו גם לנתח מדולרי טמון ותאי טחול לאחר immunophenotyping. מגבלות נתקלו כאשר פנוטיפ התא C1498 נבדק באיברים כפי שהם הביעו כמה סמנים hematopoietic (רק מעטים מהם היו + B220). כדי להגדיר את אופיו של לוקמיה חריפה ציין, מכתים מאי-גרונוולד Giemsa וניתוח של פעילות monocytic ו esterases granulocytic בוצעו באמצעות מח עצם. התוצאות הראו כי C1498 תאים נשמרו מורפולוגיה מוח העצם ואת monoblastic שלהם ותפקוד, חושפים את התחלתה של לוקמיה myelomonocytic.
<p class = "jove_content"> בתמורת השלבים הקריטיים המתואר בפרוטוקול זה, יש לתת תשומת לב מיוחדת pH בעת ביצוע תגובות cytochemical והכתים MGG בגלל שגיאות ב- pH יכולות להוביל לפרשנויות שגויות של תוצאות. למשל, פעילות אסטראז בוטיראט α-naphthyl היא ספציפית לתאי monocytic רק ב- pH של 6.0 בגלל גרנולוציטים ו לימפוציטים יכולים להכתים גם חיוביים לבדיקה זו בערכי pH גבוהים יותר. Fixating התאים אינו מומלץ לפני ביצוע מכתים MGG, והראינו כי קיבעון CAF רק בתנאי תוצאות משביעות רצון בעת ביצוע esterases התגובות cytochemical באמצעות C1498 תאים. כדי לשמר את הביטוי של מולקולת CD115 וזיהוי על ידי cytometry זרימה, כל הדגימות (למשל, דם, מח עצם, תאי טחול) יש לשמור על הקרח במהלך ההליך. אם לא מכתים הוא ציין זרימת cytometry או / וניסויים immunofluorescence, ההתייחסות של נוגדנים, מחדש האחסון שלהםלשבח הדילולים שלהם צריכים להיבדק. ההתייחסויות המפורטות בטבלת חומרים / ציוד נבחרו עבור יישומי cytometry זרימה או immunofluorescence. בפריימריס / נוגדנים משני או fluorophores מצומדות שלהם עלולים לאבד את פעילותם בשל אחסון לא הולם (למשל, חשיפה לאור או חום), דילול פסול, הקפאה / פשרה נרחבת או שימוש מאגרים מזוהמים. הפעל בקרות חיוביות כדי לוודא שהם פועלים כראוי. השתמש במח עצם עכבר או נגזרות תאי טחול שידועים כי הם מבטאים את החלבונים של עניין. כדי למנוע רקע גבוה מכתים הלא ספציפי, לוודא כי התאים נשטפים כראוי והמשיכו ב לחות גבוהה (עבור immunofluorescence) וכי הנוגדנים הם בדילול כפי שהורה. השתמש באותו הריכוז ודילול עבור נוגדן אלוטיפ ואת הנוגדן הראשוני כדי לקבוע את רמת הרקע במדויק במדגם. בניסויים אסטראז cytochemistry, אתריאגנטים יכול להיבדק באמצעות שקופיות בקרה חיוביות ושליליות המכילות granulocytic טחול עכבר מטוהר (Ly6G +) ו monocytic (CD115 +) תאים.ההליך המתואר במחקר זה הראה כי חלק ניכר מן תכונות leukemic נצפו בעכברים לאחר ההזרקה של תאי C1498 משותף היכר משותף עם לוקמיה החריפה myelomonocytic אדם 11,12. תאי leukemic פלשו הביאו לירידה של (אבות ומבשרים) בוגרת בשלה תאי hematopoietic מדולרי. תאי C1498 נוכחים בתדר גבוה (> 20%) בדם ההיקפי, כמו גם תאי monocytic. Hepatomegaly ו splenomegaly נצפו לנבוע חדירת תאים leukemic, ולשיפור משמעותי לימפוציטים מסוג B ותאי מיאלואידית נצפו גם ללוות splenomegaly. Thrombopenia נצפתה גם כאשר מספרים טסיות דם נאמדו באמצעות נתח המטולוגיה.
זו הייתה הצגהn, באמצעות בניסויים במבחנה, כי C1498 תאים לעכב hematopoiesis בעכברים נורמליים ידי הפרשת גורמים מסיסים 13. בכמה מודלי עכבר גידול, תאי מיאלואידית מפותחים (כולל monocytic ותאי granulocytic) יש גם הוכחו להגר ממח העצם אל הטחול, שם הם לעכב הפעלת תא T ספציפית אנטי סרטנית ושגשוגם 14. לפיכך, הפחתת תאים hematopoietic כי נצפתה במח העצם יכולה להסתיים משני מחסור hematopoiesis ו / או הגירתם. מנגנון אחרון זה יכול להסביר את נוכחותם של monocytosis בדם ההיקפי או התצפית של שברי מיאלואידית מוגדלים בטחול. זה גם מתקבל על דעת כי התאים האלה יכולים כבר נגזרו hematopoiesis טחול המשופר. ואכן, בתנאים יציבים, כמה תת קבוצות של תאי B טחול זוהו סימנים מקדימים של הבוגרת B לימפוציטים 15. יתר על כן, בתנאים דלקתיים, medגזע ואת אבות ullary תאים הוכחו לעבור הטחול כדי לגרום לייצור מונוציטים בוגר 16. פרוטוקול זה אינו מאפשר לנו להסיק מסקנות לגבי המנגנונים מעורבים בהתפתחות של לוקמיה, ונוספים פונקציונליים כמו גם צריכים להיות מועסקים מבחנים מולקולריים לעשות זאת. עם זאת, נתונים אלה כוללים מידע מפורט על המאפיינים הקליניים של לוקמיה myelomonocytic האקוטית יסייעו לחוקרים להעריך ולהבין את ההשפעות של תרופות חדשות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the “Ligue Nationale contre le Cancer” (Comité du Septentrion), the SIRIC ONCOLille (Grant INCa-DGOS-INSERM 6041) and the Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille (IRCL) for supporting this work. They would like to thank Delphine Taillieu and the animal facility staff for housing the mice and maintaining their welfare. We also thank Raphaëlle Caillerez and Nathalie Jouy for their respective help in microscopy and flow cytometry.
Materials
| C1498 cell line | ATCC | TIB 49 | |
| C57BL/6J-Ly5.1 | Charles River | B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl | |
| Cells culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol, Gibco | ThermoFisher Scientific | 21985 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10270 | |
| HEPES, Gibco (1 M) | ThermoFisher Scientific | 15630 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution, Gibco | ThermoFisher Scientific | 11140 | |
| Penicillin-Streptomycin, Gibco | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| RPMI 1640 Medium (Gibco, GlutaMAX Supplement) | ThermoFisher Scientific | 61870 | |
| Sodium Pyruvate, Gibco (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360 | |
| Flow cytometry staining reagents | |||
| anti-mouse B220 APC (1) | ebiosciences | 17-0452 | clone RA3-6B2, final dilution 1/100 |
| anti-mouse B220 biotin (2) | ebiosciences | 13-0452 | clone RA3-6B2, 1/400 |
| anti-mouse CD3 eFluor450 (1) | ebiosciences | 48-0032 | clone 17A2, 1/100 |
| anti-mouse CD3 PE (2) | BD biosciences | 555275 | clone 17A2, 1/100 |
| anti-mouse CD3 PE-Cy5 (3) | ebiosciences | 15-0031 | clone 145-2C11, 1/100 |
| anti-mouse CD4 APC (1) | ebiosciences | 17-0041 | clone GK1.5, 1/500 |
| anti-mouse CD4 PE (2) | ebiosciences | 12-0041 | clone GK1.5, 1/200 |
| anti-mouse CD8 biotin (1) | ebiosciences | 13-0081 | clone 53-6.7, 1/100 |
| anti-mouse CD8 eFluor450 (2) | ebiosciences | 48-0081 | clone 53-6.7, 1/500 |
| anti-mouse CD11a biotin | ebiosciences | 13-0111 | clone M17/4, 1/100 |
| anti-mouse CD11b PE | ebiosciences | 12-0112 | clone M1/70, 1/200 |
| anti-mouse CD16/32 biotin | ebiosciences | 13-0161 | clone 93, 1/400 |
| purified anti-mouse CD16/32 (FcR blocking) | BD biosciences | 553141 | clone 2.4G2 |
| anti-mouse CD18 biotin (1) | ebiosciences | 13-0181 | clone M18/2, 1/100 |
| anti-mouse CD18 FITC (2) | ebiosciences | 11-0181 | clone M18/2, 1/50 |
| anti-mouse CD19 PE | ebiosciences | 12-0193 | clone 1D3, 1/200 |
| anti-mouse CD21/35 PE | ebiosciences | 12-0211 | clone 8D9, 1/50 |
| anti-mouse CD31 PE | ebiosciences | 12-0311 | clone 390, 1/100 |
| anti-mouse CD34 eFluor660 | ebiosciences | 50-0341 | clone RAM34, 1/20 |
| anti-mouse CD44 PE | BD biosciences | 553134 | clone IM7, 1/50 |
| anti-mouse CD45.2 FITC | ebiosciences | 11-0454 | clone 104, 1/100 |
| anti-mouse CD49b/Pan NK PE | BD biosciences | 553858 | clone DX5, 1/50 |
| anti-mouse CD80 biotin | ebiosciences | 13-0801 | clone 16-10A1, 1/200 |
| anti-mouse CD86 biotin | ebiosciences | 13-0862 | clone GL1, 1/200 |
| anti-mouse CD107b (Mac-3) PE | ebiosciences | 12-5989 | clone M3/84, 1/40 |
| anti-mouse CD115 PE | ebiosciences | 12-1152 | clone AFS98, 1/100 |
| anti-mouse CD117 eFluor450 | ebiosciences | 48-1171 | clone 2B8, 1/100 |
| anti-mouse CD127 PE | ebiosciences | 12-1271 | clone A7R34, 1/100 |
| anti-mouse CD150 APC | ebiosciences | 17-1501 | clone 9D1, 1/20 |
| anti-mouse CD274 (PD-L1) biotin | ebiosciences | 13-5982 | clone MIH5, 1/200 |
| anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE | ebiosciences | 12-5981 | clone D7, 1/100 |
| anti-mouse Ly-6C APC | ebiosciences | 17-5932 | clone HK1.4, 1/200 |
| anti-mouse Ly-6G (Gr-1) biotin (1) | ebiosciences | 13-5931 | clone RB6-8C5, 1/400 |
| anti-mouse Ly-6G FITC (2) | ebiosciences | 11-9668 | clone 1A8, 1/50 |
| anti-mouse MHC class I (H-2Db) biotin | ebiosciences | 13-5999 | clone 28-14-8, 1/50 |
| anti-mouse MHC class II (I-A/I-E) PE-Cy5 | ebiosciences | 15-5321 | clone M5/114.15.2, 1/1000 |
| anti-mouse NK1.1 PE | BD biosciences | 557391 | clone PK136, 1/50 |
| anti-mouse TCRVb FITC | BD biosciences | 553170 | clone H57-597, 1/50 |
| streptavidin PE-Cy5 | ebiosciences | 15-4317 | 1/200 |
| Immunofluorescence staining reagents | |||
| Anti-mouse myeloperoxidase (heavy chain antibody) | Santa Cruz Biotechnology | sc-16129 | 1/10 (20 µg/ml) |
| anti-goat IgG (Texas Red coupled antibody) | Jackson Immunoresearch | 705-076-147 | 1/250 |
| Normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | |
| Hoechst solution | BD Biosciences | 561908 | 1/1000 |
| Mounting medium 1 (Fluoromount) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Acetone | VWR | 20066 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Esterase cytochemical staining reagents | |||
| Naphtol AS-D chloroacetate solution | Sigma-Aldrich | 911 | |
| Dye solution (Fast Red Violet LB Base solution) | Sigma-Aldrich | 912 | |
| pH6.3 buffer concentrate (TRIZMAL) | Sigma-Aldrich | 913 | |
| Sodium nitrite solution | Sigma-Aldrich | 914 | |
| Citrate solution | Sigma-Aldrich | 915 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GHS3 | |
| Acetone | VWR | 20066 | |
| Formaldehyde solution, 37% | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| α-naphthyl butyrate solution | Sigma-Aldrich | 1801 | |
| Phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Sodium nitrite Tablet | Sigma-Aldrich | 1809 | |
| Pararosaniline solution | Sigma-Aldrich | 1804 | |
| Methylene blue solution | Sigma-Aldrich | 1808 | 1/10 |
| mounting medium 2 (Clearmount) | Invitrogen | 00-8010 | |
| May-Grünwald Giemsa staining reagents | |||
| May-Grünwald solution | RAL Diagnostics | 320070 | |
| Giemsa R solution | RAL Diagnostics | 320310 | 1/20 |
| pH 6.8 buffer solution | RAL Diagnostics | 330368 | |
| Others materials, reagents and equipment | |||
| Ketamine 1000 (100 mg/mL) | VIRBAC | 3597132111010 | |
| Xylazine SEDAXYLAN (20 mg/mL) | CEVA | ||
| Bovin albumin serum (BSA) powder | ThermoFisher Scientific | BP671 | |
| PBS solution (1x concentrate) | ThermoFisher Scientific | 14190 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Ultra Pure 0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575 | |
| Separating solution (Pancoll Mouse) | PANBIOTECH | P04-64100 | |
| Lysis buffer (Red Blood Cells Lysing Buffer) (10X) | BD Biosciences | 555899 | 1/10 |
| NaOH 10N | ThermoFisher Scientific | SS267 | |
| Trypan blue solution (0.4 %) | ThermoFisher Scientific | 15250-061 | 1/2 |
| 50 mL tube (Falcon) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70µm Cell Strainer (Falcon) | Corning Life Sciences | 352350 | |
| Chamber & filter card (EZ Cytofunnel Shandon) | Thermo Scientific | A78710003 | |
| Microscope Cover Glasses, 24x24mm | Knittel Glass | VD1 2424 Y100 | |
| Slides (Starfrost – ground edges 90) | Knittel Glass | VS1137# 077FKB | |
| EDTA Tube | Greiner Bio-One | 454034 | |
| Pasteur Pipette 150MM (capillary tube) | Fisherbrand | 1154-6963 | |
| 26G needle | Terumo | NN-2613R | |
| insulin syringe and needle 29G | Terumo | BS05M2913 | |
| 30G needle | Becton & Dickinson | 304000 | |
| Flow cytometry tubes (blue) | Beckman Coulter | 2523749 | |
| Water-repellent pen (Dakopen) | Dako | S200230 | |
| Sharp sterile scissors | Nessi-care | SCI-01 | |
| Sterile forceps | Dominique Dutscher | 956506 | |
| Thoma cell counting chamber | VWR | 631-0397 | |
| Petri Dishes (Fisherbrand Plastic) | ThermoFisher Scientific | S33580A | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| Cylindrical Restrainer 15-30 gm | Stoelting | 51338 | |
| Shandon Cytospin 3 Cytocentrifuge | ThermoFisher Scientific | ||
| 10 mL syringe | Terumo | SS-10L | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Ethanol | Merck | 1.08543 | |
| Sterile gauze sponges | URGO | 501580 |
References
- Forthun, R. B., Hinrichs, C., Dowling, T. H., Bruserud, &. #. 2. 1. 6. ;., Selheim, F. The past, present and future subclassification of patients with acute myeloid leukemia. Curr. Pharm. Biotechnol. 17 (1), 6-19 (2016).
- Goldie, H., Butler, C. H., Anderson, M. M., Maxwell, M. C., Hahn, P. F. Growth characteristics of free C1498 (granulocytic leukemia) tumor cells in the peritoneal fluid and the blood of C57 mice. Cancer Res. 13 (2), 125-129 (1953).
- Tanaka, K. K., Roberts, E. Biological studies of E.L.4 lymphoma and C Leukemia in susceptible (C57BL) and resistant (B10.D2) mice. Cancer Res. 24 (1498), 1785-1797 (1964).
- Law, L. W. Characterization of an influence affecting growth of transplantable leukemias in mice. Cancer Res. 4, 257-260 (1944).
- Graham, J. D., McMahon Welch, C., Patchen, M. L. Studies of an implanted murine myelogenous leukemia C1498. Ohio J. Sci. 75 (4), 202-208 (1975).
- Boyer, M. W., Orchard, P. J., Gorden, K. B., Anderson, P. M., Mclvor, R. S., Blazar, B. R. Dependency on intercellular adhesion molecule recognition and local interleukin-2 provision in generation of an in vivo CD8+ T-cell immune response to murine myeloid leukemia. Blood. 85 (9), 2498-2506 (1995).
- Labelle, J. L., Truitt, R. L. Characterization of a murine NKT cell tumor previously described as an acute myelogenous leukemia. Leuk. Lymphoma. 43 (8), 1637-1644 (2002).
- Bradner, W. T., Pindell, M. H. Myeloid leukemia as a screen for cancer chemotherapeutic agents. Cancer Res. 26 (4), 375-390 (1966).
- Lin, J. M., Li, B., Rimmer, E., VanRoey, M., Jooss, K. Enhancement of the anti-tumor efficacy of a GM-CSF-secreting tumor cell immunotherapy in preclinical models by cytosine arabinoside. Exp. Hematol. 36 (3), 319-329 (2008).
- Robinson, J. P. . Handbook of Flow Cytometry Methods. , (1993).
- Xu, Y., McKenna, R. W., Wilson, K. S., Karandikar, N. J., Schultz, R. A., Kroft, S. H. Immunophenotypic identification of acute myeloid leukemia with monocytic differentiation. Leukemia. 20 (7), 1321-1324 (2006).
- Hassan, K., Qureshi, M., Shafi, S., Ikram, N., Akhtar, M. J. Acute myeloid leukemia-FAB classification and its correlation with clinico-haematological features. J. Pak. Med. Assoc. 43 (10), 200-203 (1993).
- Quesenberry, P. J., Rappeport, J. M., Fountebouni, A., Sullivan, R., Zuckerman, K., Ryan, M. Inhibition of normal murine hematopoiesis by leukemic cells. N.Engl.J. Med. 299 (2), 71-75 (1978).
- Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. 181 (8), 5791-5802 (2008).
- Loder, F., et al. B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals. J. Exp. Med. 190 (1), 75-89 (1999).
- Robbins, C. S., et al. Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions. Circulation. 125 (2), 364-374 (2012).
Cite This Article
Mopin, A., Driss, V., Brinster, C. A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model. J. Vis. Exp. (116), e54270, doi:10.3791/54270 (2016).