Los ensayos in vitro de transcripción y su aplicación en el descubrimiento de medicamentos
Summary
In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.
Abstract
Los ensayos in vitro de transcripción se han desarrollado y utilizado ampliamente durante muchos años para estudiar los mecanismos moleculares implicados en la transcripción. Este proceso requiere de múltiples subunidades de ADN-polimerasa dependiente de ARN (RNAP) y una serie de factores de transcripción que actúan para modular la actividad de RNAP durante la expresión génica. electroforesis en gel de secuenciación de transcritos radiomarcados se utiliza para proporcionar información sobre el mecanismo de transcripción detallada sobre cómo avanza y los parámetros que pueden afectarlo. En este trabajo se describe el protocolo para estudiar cómo el factor de elongación esencial Nusa regula pausa transcripcional, así como un método para identificar un agente antibacteriano de orientación iniciación de la transcripción a través de la inhibición de la formación de RNAP holoenzima. Estos métodos se pueden utilizar como una plataforma para el desarrollo de enfoques adicionales para explorar el mecanismo de acción de los factores de transcripción que aún siguen sin estar claros, así como nueva agen antibacterianots la orientación de la transcripción que es una diana farmacológica infrautilizado en la investigación y el desarrollo de antibióticos.
Introduction
La transcripción es el proceso en el que el ARN se sintetiza a partir de un molde de ADN específico. En las células eucariotas hay tres RNAPs distintas: RNAP I transcribe precursores rRNA, RNAP II es responsable de la síntesis de mRNA y ciertos pequeños ARN nucleares, y la síntesis de 5S rRNA y tRNA se realiza por RNAP III. En las bacterias, sólo hay un RNAP responsable de la transcripción de todas las clases de ARN. Hay tres etapas de la transcripción: iniciación, elongación y terminación. La transcripción es uno de los procesos más altamente regulados en la célula. Cada etapa del ciclo de la transcripción representa un punto de control para la regulación de la expresión génica 1. Para la iniciación, RNAP tiene que asociar con un factor sigma para formar la holoenzima, que se requiere para dirigir la enzima a sitios específicos llamados promotores 2 para formar un complejo promotor abierta. Posteriormente, un gran conjunto de factores de transcripción son responsables de la regulación of RNAP actividades durante las fases de elongación y terminación. El factor de transcripción se examinan aquí es la proteína altamente conservada y esencial, Nusa. Está implicado en la regulación de pausa de la transcripción y de terminación, así como anti-terminación durante la síntesis de rRNA 3-5.
Los ensayos in vitro de transcripción se han desarrollado como herramientas poderosas para estudiar las medidas reguladoras complejas durante la transcripción 6. En general, se requiere un fragmento lineal de ADN que incluye una región promotora como la plantilla para la transcripción. La plantilla de ADN es usualmente generado por PCR o linealizando un plásmido. A continuación se añaden proteínas y los PNT (incluyendo una NTP radiomarcado con fines de detección) purificadas y productos analizados tras el período requerido de incubación. El uso de plantillas adecuadas y condiciones de reacción, todas las etapas de la transcripción se han examinado el uso de este enfoque que ha permitido la caracterización molecular detallada de transcription durante el último medio siglo 7. En combinación con la información sobre la estructura 3-dimensional de RNAP también ha sido posible investigar el mecanismo molecular de la inhibición de la transcripción por los antibióticos y los cables de antibióticos, y utilizar esta información en el desarrollo de nuevos medicamentos, la mejora de 8-10.
En este trabajo se proporcionan ejemplos de cómo los ensayos de transcripción se pueden utilizar para determinar el mecanismo de regulación por elongación de la transcripción / factor de terminación de NusA, y cómo el mecanismo de acción de una novela de plomo inhibidor de iniciación de la transcripción puede ser determinada.
Protocol
Representative Results
Discussion
En todos los organismos, la transcripción es un proceso estrechamente regulado. Los ensayos in vitro de transcripción se han desarrollado para proporcionar una plataforma para probar los efectos de los factores de transcripción, moléculas pequeñas e inhibidores de transcripción. En este trabajo el método, se describe un ensayo para la transcripción bacteriana general. los ensayos de transcripción en combinación con electroforesis en gel de secuenciación de transcritos son muy importantes par…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).
Materials
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
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