Caractérisation fonctionnelle des macrophages réglementaires qui inhibent l'immunité réactive du greffe
Summary
Les macrophages sont des cellules plastiques du système hématopoïétique qui jouent un rôle crucial dans l'immunité protectrice et l'homéostasie. Dans ce rapport, nous décrivons des techniques in vitro optimisées pour caractériser phénotypiquement et fonctionnellement les macrophages régulateurs infiltrants de greffe qui s'accumulent dans l'organe transplanté dans des conditions tolérantes.
Abstract
L'accumulation de macrophages dans les organes transplantés a longtemps été reconnue comme une caractéristique du rejet d'allogreffe 1 . Les monocytes immunogènes infiltrent l'allogreffe au début de la transplantation, montent une réponse réactive du greffon contre l'organe transplanté et initient le rejet d'organe 2 . Les données récentes suggèrent que les macrophages suppressifs facilitent la transplantation réussie à long terme 3 et sont nécessaires pour l'induction de la tolérance à la transplantation 4 . Cela suggère un concept multidimensionnel de l'ontogenèse, de l'activation et de la fonction des macrophages, qui exige une nouvelle feuille de route pour l'isolement et l'analyse de la fonction macrophage 5 . En raison de la plasticité des macrophages, il est nécessaire de fournir une méthodologie pour isoler et caractériser les macrophages, selon l'environnement tissulaire, et pour définir leurs fonctions selon différents scénarios. Ici, nous décriÊtre un protocole pour la caractérisation immunitaire des macrophages infiltrés par greffon et les méthodes que nous avons utilisées pour évaluer de manière fonctionnelle leur capacité à inhiber la prolifération de CD8 + T et à favoriser l'expansion Treg de CD4 + Foxp3 + in vitro .
Introduction
Ce protocole décrit des techniques in vitro pour étudier la fonction des macrophages infiltrant les tissus isolés à partir d'allogreffes cardiaques, selon leur capacité à moduler les réponses des lymphocytes T. Dans la littérature, les colorants fluorescents de suivi des cellules en combinaison avec la cytométrie en flux sont des outils puissants pour étudier la fonction suppresseur de types de cellules spécifiques in vitro et in vivo. Notre protocole suit la méthode de l'ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (CFSE) pour surveiller la prolifération des lymphocytes in vitro .
Lorsqu'une cellule marquée par le CFSE se divise, sa descendance acquiert la moitié du nombre de molécules marquées par la carboxyfluorescéine 6 . La diminution correspondante de la fluorescence cellulaire par cytométrie de flux peut être utilisée pour évaluer la division cellulaire, en surveillant la capacité des macrophages suppressifs à moduler les réponses immunitaires des lymphocytes T. Puisque le CFSE est un colorant à base de fluorescéine, il est compatible avec un brOuad d'autres fluorochromes, ce qui le rend applicable à la cytométrie de flux multicolores. Le choix approprié des fluorochromes pour le phénotypage est également important pour éviter le chevauchement spectral excessif et l'incapacité de reconnaître les cellules positives aux anticorps, en particulier avec des colorants protéiques visibles tels que le CFSE 7 .
Il existe de nombreux avantages d'utiliser des colorants fluorescents sur des techniques alternatives qui mesurent la prolifération cellulaire, comme le dosage d'incorporation de thymidine, qui utilise une thymidine radiomarquée (TdR) 8 . Ce dosage utilise de la thymidine tritiée (3H-TdR) qui est incorporée dans de nouveaux brins d'ADN chromosomique lors de la division des cellules mitotiques. Une préoccupation de sécurité associée à cet essai est l'utilisation de radio-isotopes, car un compteur bêta à scintillation est utilisé pour mesurer la radioactivité dans l'ADN récupéré à partir des cellules afin de déterminer l'étendue de la division cellulaire. Sur le plan méthodologique, le culot thymidine tritiéAy n'est pas suffisamment souple pour tenir compte des importantes contraintes de laboratoire clinique telles que le faible nombre de cellules et l'analyse retardée après coloration. Au contraire, la coloration au CFSE a été démontrée pour prévenir la prolifération cellulaire et pour interférer avec les marqueurs critiques d'activation, tels que CD69, HLA-DR et CD25 9 . Par conséquent, la compréhension des avantages et des limites de chaque méthodologie, en particulier dans les études multicolores où les colorants multiples sont utilisés pour suivre différents types de cellules, est essentielle pour obtenir des résultats précis et reproductibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit les méthodes utilisées pour immuno-caractériser les sous-ensembles de cellules myéloïdes infiltrantes de greffe dans un modèle murin expérimental de transplantation cardiaque, qui s'applique également à d'autres tissus dans différents modèles expérimentaux murins. Le triage cellulaire à basse pression à 20 psi était la méthode préférée pour isoler un bon rendement de sous-ensembles de cellules pures. Le maintien de la pureté de chaque sous-ensemble myéloïde est essentie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons les contributions techniques des centres d'excellence en recherche de cytométrie de flux, de micro-chirurgie et de bio-dépôt / pathologie au mont Sinaï. Ce travail a été soutenu par l'Action COST BM1305: Action pour mettre au point et accélérer les thérapies tolératives cellulaires (A FACTT), les fonds de développement de Mount Sinai Recanati / Miller Transplantation Institute, Ministerio de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R et SAF2016-80031-R JO
Materials
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100X Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 micron Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
References
- Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
- Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection. J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).
- Garcia, M. R., et al. Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice. J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).
- Conde, P., et al. DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance. Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J Vis Exp. (70), e4287 (2012).
- Poujol, F., et al. Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2’deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement. J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).
- Last’ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp. (6), e238 (2007).
- Ochando, J., Conde, P., Bronte, V. Monocyte-Derived Suppressor Cells in Transplantation. Curr Transplant Rep. 2 (2), 176-183 (2015).
- Gallina, G., et al. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).
- Huang, B., et al. Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).
- Luan, Y., et al. Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion. Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).
- Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry. Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).
