Determinação do biofilme Iniciação em células infectadas por vírus por bactérias e fungos
Summary
A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.
Abstract
O estudo das interacções polimicrobianas através dos reinos taxonómicos que incluem fungos, bactérias e vírus não tenham sido previamente analisados no que diz respeito à forma como membros virais da microbiota afectar micróbio subsequentes com estas células hospedeiras infectadas pelo vírus. A co-habitação com o vírus de bactérias e fungos é principalmente presentes nas superfícies das mucosas da cavidade oral e do tracto genital. células da mucosa, particularmente aqueles com infecções virais latentes crónicas ou persistentes persistentes, poderia ter um impacto significativo sobre os membros do microbioma através da alteração vírus em número e tipo de receptores expressos. Modificação em arquitectura membrana celular do hospedeiro iria resultar em capacidade alterada dos membros posteriores da flora normal e patógenos oportunistas para iniciar o primeiro passo na formação de biofilme, ou seja, a adesão. Este estudo descreve um método para a quantificação e exame visual do efeito de HSV na iniciação de biofilm formação (aderência) do S. aureus e C. albicans.
Introduction
O microbioma humano inclui diversos organismos de vários reinos taxonômicos que compartilham regiões geográficas no corpo. Aderência a superfícies celulares é um primeiro passo essencial na formação de biofilme, que é parte do processo de microbioma colonização. Incluído no microbioma pode ser vírus que causam infecções crônicas e persistentes. A infecção crónica de células por estes vírus pode provocar uma alteração na disponibilidade de receptor putativo. 1,2 Além disso, a entrada celular por agentes patogénicos intracelulares podem também afectar a fluidez da membrana hospedeiro / hidrofobicidade, que por sua vez podem alterar a ligação de outros membros microbioma, incluindo bactérias e fungos . A fim de compreender as interações que podem ocorrer entre esses vários patógenos que co-localizam nas mesmas regiões geográficas do hospedeiro humano, devemos ser capazes de estudar a interação de agentes patogénicos que representam o espectro de reinos taxonômicos presentes na superfície da mucosa.
t "> O Herpesviridae é uma família de micróbios presentes em 100% dos seres humanos como membros permanentes da microbiota 3,4. Além disso, eles podem também ser persistentemente derramado ambos na presença e ausência de sintomas. Especificamente, o vírus herpes simplex-1 e vírus herpes simplex-2 (HSV-1 e HSV-2, respectivamente) são membros permanentes do microbioma na oronasopharynx e tracto genital. nos indivíduos imuno-competentes, ambos de HSV-1 e HSV-2 causa gengivoestomatites, bem como herpes genital 5-8. Nesses locais, HSV provoca uma infecção latente caracterizada por necrose tumoral crônica persistente assintomática viral derramamento 9. entrada de HSV em células resulta em alterações na expressão de superfície do nectins, sulfato de heparano, jangadas lipídicas e herpesvírus mediador de entrada / receptor do factor (HVEM / TNFr) 10-25. Estes receptores representam potencialmente partilhadas para algumas bactérias e fungos, por exemplo, S. aureus e C. albicans, enquanto que agentes patogénicos oportunistas,também pode residir como membros do microbioma da mucosa do oronasopharynx 26,27. Dentro do oronasopharynx S. aureus e C. albicans ocupar dois locais distintos de colonização. Em hospedeiros com os dentes naturais, a mucosa oral é partilhada por HSV-1 e C. albicans, enquanto as narinas nasais anteriores são ocupados por S. aureus 28. No entanto, apesar achados in vitro que S. aureus adere às células epiteliais bucais, 29,30 S. aureus é pouco isolado a partir de amostras orais quando o tecido normal está presente 29,30. Pouco se sabe a respeito genitais nichos co-colonização do trato além dos achados clínicos que S. aureus está associada com vaginite aeróbica, caracterizada por genital inflamação, descarga e dispareunia, enquanto C. albicans produz lesões nas mucosas semelhantes ao observado na cavidade oral 31-35. Assim, embora estes membros da Microbi oral e genitalome reinos taxonômicos transversais pouco se sabe sobre a sua interação como ele afeta a sua capacidade de iniciar a formação de biofilme através da adesão à superfície da célula hospedeira 5. Este protocolo tem sido efetivamente aplicada para determinar as consequências funcionais de co-colonização / infecção.Protocol
1. HSV Cepas e Manuseamento Nota: recombinante não-invasiva de HSV-1 (KOS) gL86 e HSV-2 (KOS) 333gJ – com actividade repórter de beta-galactosidase utilizados foram fornecidos por V. Twiari 36,37. Use vírus a partir de um único lote e armazenar a -80 ° C a uma razão de 1: 1 de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com soro de bovino fetal a 20% (FBS) e leite desnatado até à sua utilização. Antes do armazenamento lote viral, determinar a concentração de vírus d…
Representative Results
O nível de robustez dos dados que podem ser obtidos a partir do sistema descrito neste relatório é mostrado na Figura 2 AF 38. Através da utilização deste sistema a modulação da interacção de estafilococos e fungos com células viralmente infectadas e o seu efeito sobre a adesão de cada um pode ser delineado. Estes tipos de estudos requerem um exame microscópico da interacção, como mostrado nas Figuras 3 e 4 <sup…
Discussion
Actualmente não há informações disponíveis sobre as interacções complexas entre permanente aos membros semi-permanentes do microbioma acolhimento que atravessam vários domínios taxonómico, ou seja, procariotas, eucariotas e virais. Por isso, desenvolvemos um romance no sistema de modelo in vitro para estudar a iniciação biofilme por S. aureus e C. albicans em HSV-1 ou HSV-2 infectadas células HeLa (HeLa 229) 38. O sistema modelo de células He…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).
Materials
| C.albicans | |||
| BBL Sabouraud Dextrose | BD | 211584 | |
| Fungisel Agar | Dot Scientific | 7205A | |
| S.aureus | |||
| Mannitol Salt Agar | Troy Biologicals | 7143B | |
| Sheep blood agar | Troy Biologicals | 221239 | |
| Hela cells | |||
| 1xDMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CM | |
| Gentamicin 50mg/ml | Sigma | 1397 | 50µg/ml final concentration in the complete DMEM |
| Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53M EDTA)Solution 1X | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% final concentration in the complete DMEM |
| Other medium and reagents | |||
| ONPG | Thermo Scientific | 34055 | |
| Ultra-Pure X gal | Invitrogen | 15520-018 | |
| 1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) | Corning | 20-021-CV | |
| 1XPBS | Dot Scientific | 30042-500 | |
| RIPA Lysis | Life Technologies | 89901 | |
| Staining | |||
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| HSV 1&2, specific for gD | ViroStat | 196 | |
| DAPI | SIGMA | D8417-5MG | |
| Gram Crystal Violet | Troy Biologicals | 212527 | |
| Supplies | |||
| Petri dish 100X15 | Dot Scientific | 229693 | |
| Petri dish 150X15 | Kord Valmark | 2902 | |
| 96-Well plates | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | |
| 24-well plates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Culture tubes 100×13 | Thomas Scientific | 9187L61 | |
| Cover slip circles, 12mm | Deckglaser | CB00120RA1 |
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Cite This Article
Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).