Bakteriyel Spor Filizlenmesinin sırasında Cortex Fragments algılama
Summary
Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.
Abstract
The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.
Introduction
Endosporlar metabolik bakteriler olumsuz ortamlarda devam izin bakterilerin uyuyan biçimleridir. Birçok spor oluşturan Bakterilerde Spor Oluşumu besin maddesinde yoksun kalma ile indüklenen, ancak bu işlem, oksijen ve diğer streslere 1 pH, maruz değişiklikleri ile kontrol edilebilir. Onların metabolik dormant spor formunda iken, bakteri, UV radyasyonu, kuruma, yüksek sıcaklıklarda ve 2 dondurma karşı. Sporlanma sürecine bilginin çoğu model organizma çalışmalarda, Bacillus geliyor. Sporlanma süreci DNA replikasyonu ve eksenel flamanlı 3,4 oluşumu ile başlar. Asimetrik septum daha sonra iki eşitsiz boyutlu bölmeye hücreyi böler. Daha büyük bölme, ana hücresi, küçük bölmesini, forespore engulfs. anne hücresi ve Dorman bırakmadan, sporu ve sonunda lyses anne hücreyi olgun gen ifadesini koordine forespore Hemçevreye 1 içine t spor.
spor yapısı ve bileşimi birçok bakteri türleri boyunca muhafaza edilir. Spor çekirdek vejetatif hücrenin daha düşük bir su içeriğine sahiptir ve dipikolinik asit (DPA) 1,2 ile zengindir. spor oluşumu sırasında, DPA su karşılığında spor iç kısım içine pompalanır. Çekirdeği çevreleyen en sporlu bakterilerin, çimlenme (germinants) uyaran küçük moleküller tanıyan reseptörleri 2 bulunduğu, bir iç spor bir zardır. Sadece spor iç zarının dışında bulunan hücre duvarı peptidoglikan bir tabakadır. Bir uzman peptidoglikan tabakanın (korteks) hücre duvarı peptidoglikan çevreleyen ve [N-asetilglukosamin (NAG) ve N-asetilmuramik asit (NAM) alternatif] hücre duvarı peptidoglikan aynı bileşenlerin çoğu oluşmaktadır. Bununla birlikte, korteks NAM tortularının yaklaşık olarak% 50 muramic-δ-laktam 5,6 dönüştürülmüş </s> Yukarı. spor çimlenme sırasında bu muramic-δ-laktam artıkları böylece korteks değil hücre duvarı (çimlenme tamamlamak için gerekli bir süreç) bozulmuş sağlayan, spor korteks parçalayıcı enzimlerin (SCLEs) tarafından kabul edilmektedir. Korteksi çevreleyen bir dış zar ve kaplama proteinlerinin 2 birkaç kat olduğunu.
çimlenme sürecini kontrol sporlu bakteriler için büyük önem taşımaktadır. Filizlenen reseptörler kendi germinants 2 etkileşimde bulunduğunuzda Çimlenme başlatılır. Birçok spor oluşturan bakteri, bu germinants 2 olan amino asitler, şekerler, nükleotid, iyon ya da bunların kombinasyonları bulunmaktadır. C difficile spor çimlenmesi bazı safra asitleri [örneğin, taurokolik asit (TA)] ve amino asitler (örneğin, glisin) 7-10 kombinasyonları ile başlatılır. C arasında farklılıklar olmasına rağmen difficile çimlenme yolu ve okudu yolların diğer sporluörneğin B. bakteriler, subtilis, tüm ortak bir vejetatif hücre çimlenmiş sporun 2,8 büyümeye izin spor korteksi düşmesine mutlak bir gerekliliktir. Ya SLEC (B. subtilis içinde bulunduğu gibi) (birçok Clostridia bulunduğu gibi) Korteks bozunma SCLEs CwlJ / SleB ile gerçekleştirilebilir. Korteks hidroliz hücre duvarı ve sporun üzerinde kısıtlama azaltır. Bu, tam çekirdek rehidrasyon, hücre metabolizması 2 için gerekli olan proteinlerin birçok yeniden aktive gerekli bir adım için izin verir.
Sporların filiz olduğunda, bir faz-karanlık durumu ve bu işlem için bir faz parlak durumundan atıl spor değişiklikleri 600 optik yoğunluk (OD) bir değişiklik ile ölçülebilir nm 11. Bir önceki raporda OD bu değişimin çok sporla 12 DPA salınımına bağlı olduğunu göstermektedir. Bizim son çalışma sırasında, biz C. zamanlamasını karşılaştırmak için çalıştı difficile spor çimlenmesi ve izlenenDPA ve korteks parçalarının 9 sürümü. Onlar sporlar çimlenme tarafından piyasaya sürülecek başladı bu çalışma için korteks parçalarının serbest bırakılmasını izlemek için önemliydi.
Burada kullanılan kolorimetrik deney indirgeyici uçları olan şekerleri tespit etmek için bir yöntem dayanmaktaydı Ghuysen ve ark., 13 geliştirilmiştir. Diğerleri indirgen şekerlerin 14 tespiti için protokoller tarif etmişlerdir ya da bu protokolleri 15 modifiye Çünkü, bu konuda literatür kafa karıştırıcı olabilir. Burada, C çimlenme kurtuldu indirgeyici şekerlerin kolorimetrik tespiti için detay bir adım-adım yöntemi biz difficile sporlarının. Bu çalışmada C kullanır rağmen difficile sporları, diğer sporlu bakterilerden sporların çimlenmesi sırasında salınan indirgeyici şekerler bu protokol 9,16,17 ile tespit edebiliyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
stimülasyon üzerine çimlenme süreci geçiren sporları makromoleküler sentez için gerek kalmadan kendi direnç özelliklerini kaybederler. Spor çimlenmesi tetiklendiğinde, spor çekirdek su 2 karşılığında DPA serbest bırakır. Nedeniyle atıl sporun yüksek DPA içeriğine, spor çekirdek genişleme 2 önünde bir engel olarak, muhtemelen, hareket ederek şişme çekirdek engeller yoğun olarak ozmotik basınç ile özel bir peptidoglikan, korteks altındadır.
<p class="jove_cont…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
açıklanan Proje Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Enstitüsü Ödülü Numarası 5R01AI116895 tarafından desteklenmektedir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| 2.0 mL screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| p200 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| p20 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| 100-1250uL pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1-200uL pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid – 10N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine | |||
References
- Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).
- Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. Spore formation in Bacillus subtilis. Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).
- Fimlaid, K. A., Shen, A. Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes. Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).
- Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).
- Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation. J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores. J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).
- Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins. Trends Microbiol. 22 (7), (2014).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination. J Bacteriol. 197 (14), (2015).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection. PLoS Pathog. 9, e1003356 (2013).
- Moir, A., Smith, D. A. The Genetics of bacterial spore germination. Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).
- Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores. Journal of biomedical optics. 15, 056010 (2010).
- Ghuysen, J. -. M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. Enzymes that degrade bacterial cell walls. Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).
- Park, J. T., Johnson, M. J. A submicrodetermination of glucose. J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).
- Thompson, J. S., Shockman, G. D. A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls. Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).
- Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens. J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).
- Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate. Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).
- Hindle, A. A., Hall, E. A. Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection. The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).
- Kort, R., et al. Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release. Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).
- Elson, L. A., Morgan, W. T. A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine. The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).
- Ramirez, N., Abel-Santos, E. Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro. J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).
- Akoachere, M., et al. Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination. J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).
- Duncan, C. L., Strong, D. H. Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens. Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).
- Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores. J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).
- Meador-Parton, J., Popham, D. L. Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation. J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).
- Lambert, E. A., Popham, D. L. The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization. J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).
- Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy. J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).
