세균 포자 발아 동안 코어 텍스 조각 검출
Summary
Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.
Abstract
The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.
Introduction
내생 포자는 대사 세균이 불리한 환경에서 지속 할 수 있도록 박테리아의 휴면 형태이다. 많은 포자 – 형성 박테리아 포자 형성 영양 결핍에 의해 유도되지만,이 공정은 산소 또는 다른 스트레스 1 pH를 노출의 변화에 의해 제어 될 수있다. 이들 대사 휴면 포자 형태 동안 박테리아는 UV 방사선, 탈수, 고온 및이 냉동 레지스트. 포자 형성 과정에 대한 지식의 대부분 모델에서 생체 연구 고초균에서 온다. 포자 형성 과정은 DNA 복제 및 축 3,4- 필라멘트의 형성으로 시작된다. 비대칭 격막은이 불평등 크기의 구획에 셀을 분할한다. 더 큰 구획은, 머더 셀은 더 작은 구획은 forespore을 삼키기. 머더 셀과 도만을 방출 포자 결국 lyses 머더 세포 성숙의 유전자 발현을 조정 forespore 두주변 환경 1에 t 포자.
포자 구조 및 조성은 다양한 세균 종에 걸쳐 보존되어있다. 포자 코어는 식물 세포보다 낮은 수분 함량을 갖고 dipicolinic 산 (DPA) -1,2- 풍부하다. 포자 형성하는 동안, DPA 물 교환 포자 코어로 펌핑된다. 코어 주변 대부분의 포자 형성 균에, 발아 (germinants)을 자극하는 작은 분자를 인식하는 수용체 2 위치, 내부 포자 막이다. 단 포자의 내막 밖에있는 세포벽의 펩티도 글리 칸 층이다. 특수한 펩티 층 (피질) 세포벽 펩티을 둘러싸고 [N 아세틸 글루코사민 (NAG)와 N-acetylmuramic 산 (NAM)이 교대] 세포벽 펩티 같은 많은 구성 요소로 구성된다. 그러나, 피질의 NAM 잔기의 약 50 %가 무람-δ 락탐 5,6- 변환되었습니다 </s>입니다. 포자 발아 동안이 무람-δ 락탐 잔기 따라서 피질 아니라 칸막이 벽 (발아 마칠 공정)을 저하 할 수 포자 피질 용균 효소 (SCLEs)에 의해 인식된다. 피질 주변은 외부 막과 코트 단백질이 여러 층이다.
발아 과정을 제어하는 포자 형성 세균 매우 중요하다. 싹 트는 수용체는 해당 germinants 2와 상호 작용할 때 발아가 시작됩니다. 많은 포자 – 형성 박테리아에서 이러한 germinants 2 이의 아미노산, 당, 뉴클레오티드, 이온 또는 이들의 조합이다. C. 디피 포자 발아 특정 담즙산 [예를 들어, 타우로 콜린 산 (TA)] 및 아미노산 (예컨대, 글리신) 7-10의 조합에 의해 개시된다. C. 사이의 차이가 있지만 디피 발아 경로와에서 공부 경로 다른 포자 형성같은 B와 박테리아, 서브 틸리 모든 공통 식물 세포는 포자 발아 2,8 성장할 수 있도록 포자 외피 저하하는 절대 조건이다. 또는 SLEC (B. 서브 틸리에서 발견) (많은 클로스 트리 디아에서 발견) 코어 텍스 저하는 SCLEs CwlJ / SleB에 의해 달성 될 수있다. 피질 가수 분해 세포벽 및 포자의 제한을 감소시킨다. 이는 전체 코어 수분 보충, 세포 대사 (2)에 필요한 단백질의 대부분을 재 활성화에 필요한 단계 수 있습니다.
포자가 발아 할 때 위상이 어두운 상태로 공정 상 밝은 상태로부터 휴면 포자 변화는 600에서 광학 밀도 (OD)의 변화에 의해 측정 할 수있다 나노 11. 이전의 보고서는 OD의 변화의 대부분은 포자 12 DPA의 출시로 인해 있음을 시사한다. 우리의 최근의 연구 동안, 우리는 C.의 타이밍을 비교하고자 남과 어울리지 않는 포자 발아 및 모니터링되는DPA와 피질 조각 9 릴리스. 그들은 포자를 발아가 발표되기 시작으로이 연구는 피질 조각의 방출을 모니터링하는 것이 중요했다.
여기에서 사용되는 비색 분석이 환원 말단에 당류를 검출하는 방법에 기초 하였다 Ghuysen 외. (13)을 개발 하였다. 다른 사람이 환원당 (14)의 검출을위한 프로토콜을 설명했습니다 또는 이러한 프로토콜 15을 수정 한 때문에이 주제에 대한 문헌은 혼란 스러울 수 있습니다. 여기서, C. 발아에서 해방 환원당의 비색 검출 상세히에게 단계별 방법 우리 남과 어울리지 않는 포자. 이 연구는 C.를 사용하지만 남과 어울리지 않는 포자는 다른 포자 형성 균의 포자의 발아 중에 방출 된 환원당이 프로토콜 9,16,17 검출 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
자극 후, 발아 과정을 거치고 포자 고분자 합성에 대한 필요없이 저항 특성을 잃는다. 포자 발아가 트리거되면 포자 코어는 물이 교환 DPA를 발표한다. 인해 휴면 포자의 높은 DPA 콘텐츠 포자 코어는 팽창이 장벽으로, 아마도 작용하여 팽윤 코어 방지 강렬한 삼투압 및 전문 펩티, 피질 중이다.
상기 방법은 보라색의 색조에 변화 측정으로 환원당의 존재를 검?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
설명이 프로젝트는 알레르기 및 전염병 국립 연구소에서 보너스 번호 5R01AI116895에 의해 지원됩니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 알레르기 및 전염병 국립 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| 2.0 mL screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| p200 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| p20 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| 100-1250uL pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1-200uL pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid – 10N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine | |||
References
- Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).
- Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. Spore formation in Bacillus subtilis. Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).
- Fimlaid, K. A., Shen, A. Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes. Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).
- Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).
- Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation. J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores. J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).
- Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins. Trends Microbiol. 22 (7), (2014).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination. J Bacteriol. 197 (14), (2015).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection. PLoS Pathog. 9, e1003356 (2013).
- Moir, A., Smith, D. A. The Genetics of bacterial spore germination. Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).
- Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores. Journal of biomedical optics. 15, 056010 (2010).
- Ghuysen, J. -. M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. Enzymes that degrade bacterial cell walls. Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).
- Park, J. T., Johnson, M. J. A submicrodetermination of glucose. J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).
- Thompson, J. S., Shockman, G. D. A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls. Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).
- Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens. J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).
- Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate. Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).
- Hindle, A. A., Hall, E. A. Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection. The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).
- Kort, R., et al. Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release. Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).
- Elson, L. A., Morgan, W. T. A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine. The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).
- Ramirez, N., Abel-Santos, E. Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro. J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).
- Akoachere, M., et al. Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination. J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).
- Duncan, C. L., Strong, D. H. Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens. Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).
- Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores. J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).
- Meador-Parton, J., Popham, D. L. Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation. J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).
- Lambert, E. A., Popham, D. L. The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization. J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).
- Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy. J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).
