카파 (Vκ)에 대한 항체 결합 특이성 빛 체인 함유 인간 (IgM의) 항체 : Polysialic 산 (PSA) 사례 연구로 NCAM에 첨부

동물 프로토콜과 절차는 건강 지침의 국립 연구소에 따라 실시하고, 메이요 클리닉의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC 메이요 프로토콜 번호 # A51912)에 의해 승인되었다. 1. 일반 CNS 조직 준비 이형 접합체를 건너, 이형 NCAM 마우스와 야생형 (WT) 한배 새끼 (C57 / BL6) (친절 박사 린 Landmesser, 케이스 웨스턴 리저브 대학, 오하이오 주 클리블랜드에서 제공) C57 / BL6 배경에 NCAM의 결핍 (KO) 마우스를 생성합니다. NCAM KO 마우스의 유전자형 이전 32-34을 설명하고, 더욱 구체적으로 설명되지 않을 것이다. 참고 : 1.2 단계 – 1.6는 선택 사항입니다. 수술 이전하는 펜토 바르 비탈 솔루션을 관리 (재고 : 25 ㎎ / ㎖, 초기 출생 후의 각각의 성인 단계에 대한 펜토 바르 비탈의 100 분의 50 μL) 복강 내 주사 (27 게이지 바늘과 1ml를 통해주사기). 2 분 동안 기다리거나 동물까지 마취의 수술 비행기에 도달했습니다. 수술 적 단계의 마취를 유지하기 위해 각 작업 과정에서 필요에 따라 추가로 마취제를 투여. 마취의 깊이를 결정하기 위해 발가락 핀치 응답 방법을 사용합니다. 동물들은 계속하기 전에 응답해야합니다. 바로 흉곽 아래의 외피와 복부 벽을 통해 1cm 측면 절개 – 0.5합니다. 조심스럽게 다이어프램에서 간을 구분합니다. 곡선, 무딘 가위를 사용하여 횡경막에 작은 절개를합니다. 흉강을 노출 흉곽의 전체 길이를 따라 조리개 절개를 계속한다. 조심스럽게 폐를 변위, 흉곽의 한 측면을 따라 곡선, 무딘 가위를 놓고 쇄골에 흉곽 위로를 통해 상처를합니다. 반대쪽 측면에 비슷한 상처를 확인합니다. 멀리 흉골을 들어 올려 조심스럽게 심장에 연결하는 조직을 잘라. 동물에 절개를합니다'가능한 한 큰 출구를 만들 홍채 가위를 사용하여 우심방을이야. 천천히 동물의 좌심실로 인산염 완충액 (PBS) 10 ㎖를 주입 (적색광, 유속 : 1 ㎖ / 분)을 27 게이지 바늘이 장착 된 10 ㎖ 주사기를 이용하여. 조직 파괴를 방지하기 위해 관류시의 압력 / PBS 흐름을 증가시키지 않는다. 수술 가위를 사용하여 신생아 쥐 목을 벨. 겸자로 눈 소켓을 잡아와 척추에 작은 가위를 삽입하여 뇌를 제거합니다. 귀 수준에서 앞쪽으로 두개골을 잘라. 껍질은 다시 두개골과 부드럽게 얼음에 얼음처럼 차가운 해부 매체의 10 ㎖ (표 1) 가득 60mm 페트리 접시에 두뇌를 놓습니다. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 각각의 뇌를 놓고 즉시 드라이 아이스에 저장 (-79 ° C). 얼음에 깨끗한 면도날을 사용하여 냉동 뇌에서 소뇌 및 뇌 줄기를 절개. 조직을 해동 방지하기 위해 신속하게 작동한다. 체중냉동 대뇌 얼음에 15 ㎖의 튜브에 넣고 ㎕의 용해 완충액 당 150 μg의 뇌 조직의 최종 농도 빙냉 용해 완충액 (표 1 참조)를 추가한다. cerebra 나머지에 대해 반복합니다. 단계 1.9에 대해 항상 얼음에 머리를 유지 – 1.11. 27 게이지 바늘 (10 배)가 장착 된 5 mL를 주사기를 통해 저작하여 1 ml의 피펫 팁 (10 회)를 통해 분쇄하여 용해 완충액에서 균질화 뇌. 전체 조직을 용해 할 수 있도록 얼음에 추가로 30 분 동안 뇌 해물을 품어. (4 ° C에서 10 분 동안 19,000 XG에 네 라운드) 세제 불용성 물질과 뇌 직렬 원심 분리를 통해 지질을 제거합니다. 폐기 (흰색) 수초와 펠렛을 함유하는 세포 파편하지만 모든 원심 분리 단계 후 상등액을 유지합니다. 나누어지는 뇌 해물 저장 -80 ºC에서. Cerebra에서 "풀다운"에이전트와 같은 인간 IgMs (HIgM12 및 이소 제어 IgM의)를 사용하여 2. 면역 침전WT의 리터 해물과 NCAM KO 마우스 단백질 L 아가로 오스 비드 준비 9,35,36 BSA (표 1 참조)를 포함한 IP 완충액 200 ㎖를 준비한다. BSA 않고 동일한 IP 버퍼의 또 다른 200 mL의 준비. 면역 반응 전송 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 200 μL 피펫을 사용하여 단백질 L 아가로 오스 슬러리를 100 ㎕ 당. 하지 소용돌이 단백질 L 아가로 오스 비즈를 수행합니다! IP 완충액 1 ㎖를 추가하는 각 튜브 (표 1 참조). 단백질 L 아가로 오스와 반전을 통해 수동으로 IP 버퍼 (다섯 번) 섞는다. 벤치 탑 원심 분리기에 세척 단백질 L 아가로 오스 비즈 원심 분리하여 네 번 (1000 XG, 2 분, 25 ° C). 아가로 오스 펠렛을 방해하지 않고 200 μL 피펫을 사용하여 상층 액을 벗어. 반복 세척 2.1.2 세 2.1.3에 추가 번 단계를 반복합니다. 4 ºC에서 밤새도록 롤러에 새롭게 추가 된 IP 완충액 1 ml 중에 단백질 L 아가 평형. 서양 오 점에서 항체 – 항원 아가로 오스 L 복합체 형성 및 항원 검출 4 ºC에서 롤러 밤새 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 대한 IgM 항체 (HIgM12) 20 μg의 얼음처럼 차가운 IP 완충액 1 ㎖에 용해 뇌 조직 (~ 200 ㎕의 용 해물) 30 mg의 인큐베이션. 1000 XG, 4 ºC에서 2 분 동안 벤치 탑 원심 분리기 (단계 2.1.4에서) 단백질 L 아가로 오스 비즈를 스핀 다운. 아가로 오스 펠렛을 방해하지 않고 200 μL 피펫을 사용하여 상층 액을 버린다. 1 ML의 피펫을 사용하여 단백질 L 아가로 오스에 (단계 2.2.1)에서 냉각 된 항체 뇌 해물 솔루션을 추가합니다. 4 ºC에서 롤러에 2 시간 동안 항체 – 항원 단백질 L 아가 현탁액 인큐베이션. 2 분, 4 ºC 1,000 XG에서 원심 분리를 통해 L을 아가로 오스에 부착 된 항체 – 항원 복합체를 씻으십시오. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 버리고 0.2 % BSA를 포함하는 얼음처럼 차가운 IP 버퍼 1 ㎖를 추가합니다. 0.2 % BSA 및 BSA없이 빙냉 IP 버퍼를 이용하여 두 개의 추가 시간을 포함하는 빙냉 IP 버퍼를 사용하여 세척 단계를 한 번 더 반복한다. 2 분, 4 ºC 1,000 XG에서 L을 아가로 오스에 부착 된 항체 – 항원 복합체를 스핀 다운. 완전히 처음 용액 50 μL가 10 μl를 피펫 다음에 단백질 L 아가로 오스 펠렛의 상단에 남아 있습니다 ~까지 200 μL 피펫을 사용하여 상층 액을 버린다. 얼음에 샘플을 유지합니다. IP 용출 완충액 40 μl를 추가 95 ºC에서 5 분 동안 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브, 손가락 제스처 튜브 6 회 열마다 (표 1 참조). 2 분 동안 얼음에 샘플을 넣고 13,000 XG, 4 ºC에서 30 초 동안 스핀 다운. 펠렛을 방해하지 않고 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 10 μl의 피펫 (~ 35 μL 총)를 사용하여 상층 액을 전송합니다. 내부 튜브 벽에서 용출 소량의 시료를 세척하여 단백질 L 아가 구슬의 유무를 확인한다. 참고 : "세분화"단백질 L 아가로 오스 비즈는 분명히 존재하는 경우 볼 수 있습니다. 단백질 L 아가로 오스 비즈있는 경우, 13,000 XG에서 또 다른 30 ​​초 동안 샘플을 스핀 다운 튜브를 청소 뜨는을 전송합니다. 어떤 아가로 오스 비즈 검출 없을 때까지 단계를 반복합니다. 로드 10 – 트리스 / 글리신 / SDS 버퍼 시스템의 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔에 웰 당 용출 된 샘플 20 μL (표 1 참조). 참고 : – : 8.6 X 6.7 X 0.1 cm)를 사용하여 7.5 % 또는 4 PSA-NCAM 또는 NCAM 이성체 (겔 크기 (폭 x 길이 x 두께의 검출에 잘 당 50 μl를 적재 용량 20 % 그라데이션 젤. 벤치 탑 100 V에서 ~ 1 시간 동안 실행 젤 (1.74 V / cm 2). 추가 냉각이 단계 37,38 필요하지 않습니다. PVDF로 전송 단백질 (폴리 비닐 리덴 플루오 라이드) 막 차가운 전송 버퍼 사용하여 100 V의 추운 방에서 2.5 시간 (1.74 V / cm 2)에 대한 (공극 크기 0.45 μm의) (5-10 ºC)을 (표 1 참조). 블록 막 wi 번째 10 % (W / V)는 벤치 탑 궤도 통에 25 ºC에서 1 시간 동안 PBS-T에서 분유 분말, PBS-5 %의 BSA에 차 항체와 하룻밤 10 PBS-T와 분, 프로브 두 번 세포막을 씻어 추운 방에서 궤도 통에 T. 25 ºC에서 간단히 초과 PBS-T와 다음날 아침 씻어 막 한 시간은 10 분 궤도 흔드는 각 (80 회전)에 대한 PBS-T 3 세척 한 다음 (뚜껑과 용기 포함) (모든 세척 단계 25에서 수행됩니다 ºC). 이차 항체를 추가 (고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)가 HIgM12 안티 인간 항 IgM의 항체 () (희석 1 π 공역 계 : 궤도 진탕 기에서 25 ºC에서 1 시간을위한 PBS-T의 5 % 분유 분말 30,000) (70 rpm으로 ). 워시 막 광범위 25 ºC에서 간단히 초과 PBS-T와 함께 한 시간은 10 분 궤도 흔드는 각 (80 회전)에 대한 PBS-T 3 세척 한 다음 (뚜껑과 용기 포함) (모든 세척 단계는 25 ºC에서 수행됩니다) . 냉장 강화 chemiluminescen 1 ㎖를 혼합25 ºC에서 (미니 오 당) 구성 요소 B (산화제) 1 ㎖와 가전의 HRP 기판 구성 요소 A (강화 루미놀 시약). (아주 가장자리를 잡고)를 초과하는 액체를 제거하기 위해 종이 타월에 세포막을 전송하는 플라스틱 집게를 사용합니다. 다시 용기에 종이 타월 넣어 막 건조 용기 (각 막에 대해 하나). 즉시 각 막에 미리 혼합 된 강화 된 화학 발광 HRP 기질 (화합물 A + B) (단계 2.2.16.) 2 ㎖를 추가하고, 진탕 기 (90 RPM) 25 ºC에서 2 분간 배양한다. 확인 막을 균일하게 발광 시약에 의해 묻혀있다. 투명 플라스틱 슬리브로 전송 세포막을하고 종이 타월로 물기와 공기 거품을 제거합니다. 필름 카세트에 플라스틱 슬리브에 막 넣어 결국 카세트에 플라스틱 슬리브를 테이프. 카세트를 닫습니다. 암실에 카세트, 영화, 타이머와 가위를 가져 가라. 각 파이에서 오른쪽 상단 모서리를 잘라배향 상업적 필름은 다양한 기간에 대한 (다른) 필름 (10 초, 1 분, 10 분)에 노출시켜 막 현상액 필름을 개발한다. NCAM (39)에 부착 PSA 3. Endoneuraminidase-NF 소화 표 2 (39)에 도시 된 바와 같이, 출생 당일 (P) 7 WT 마우스와 P7 NCAM KO 마우스로부터 다이제스트 용해 뇌 조직 endoneuraminidase-NF (ENDO-NF)을 이용하여 얼음 위에서 2 시간 동안 (단계 1.12부터 제조 됨). 단계 3.1 (표 2)에서 – 각 튜브 (6 일)에 4 배 램 믈리 샘플 버퍼의 5 μl를 추가합니다. 4에로드 샘플 – 20 % 구배 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔를 반복 2.2.19로 2.2.10 단계를 반복합니다. PBS에서 5 % BSA에서 HIgM12 (1 μg의 / ㎖) 시판 항 PSA 단클론 항체 (클론 2-2B) (1 μg의 / mL) 및 β 액틴 항체 (하중 제어) (1 μg의 / ㎖)와 프로브 멤브레인 -티. 쥐와 마우스 CNS 문화 4. 준비 <strong> 유리 Coverslips는 제조 유리 용기를 사용하여 흄 후드에서 16 시간 – 4 60 ºC – 50에서 1 M 염산에 산 세척 25mm 커버 글라스. 가끔 부드러운 소용돌이를 통해 커버 슬립을 선동. 세척 유리는 광범위하게 증류수 (3 배)으로 된 커버. 누적 된 커버 사이에 산을 씻어해야합니다. 100 % 에탄올에 커버 슬립을 씻어 세포 배양 후드에서 파라 필름에 그들을 건조. 하루 사용하기 전에, 오븐에서 100 ºC에서 뚜껑을 유리 용기에 24 시간 동안 유리 커버 슬립을 가열한다. 37 ºC에서 1 시간 동안 멸균 물에 40 μg의 / ㎖ 폴리 D 라이신 3 ㎖와 6 자 요리와 코트 커버 글라스를 넣습니다. 멸균 물로 2 회 세척 세포 배양 후드 완전히 건조 20 분 동안 자외선을 적용합니다. CNS 세포에 대한 조직 문화 플라스틱의 제조 3 코트 60mm 세포 배양 접시 또는 75cm 두 조직 문화 플라스크용액 10 ml를 각각 37 ºC에서 1 시간 동안 멸균 수 / ㎖ 폴리 D 라이신 40 μg의 중. , 물로 2 회 세척 세포 배양 후드 완전히 건조 20 분 동안 자외선을 적용합니다. 쥐 혼합 아교 절연 (40) IACUC는 CO 2 가스 공급 (완전이 자동화)와 쥐 안락사 챔버 승인에 신생아 쥐를 마취. 동물의 응답 중지를 결정하기 위해 발가락 핀치 응답 방법을 사용합니다. (- 한 번에 10 새끼 6) 신생아 스프 라그 돌리 쥐 (P0P1)를 목을 벨. 겸자로 눈 소켓을 잡아와 척추에 작은 가위를 삽입하여 뇌를 제거합니다. 귀 수준에서 앞쪽으로 두개골을 잘라. 껍질은 다시 두개골과 부드럽게 (표 1 참조) 얼음에 얼음처럼 차가운 해부 매체 10 ㎖로 가득 60mm 페트리 접시에 두뇌를 놓습니다. (- 10 새끼 6) 쥐의 새끼를 나머지에 대해 반복합니다. 4.3.7 – 4.3.2 단계 얼음에 조직을 유지합니다. </리> 두 대뇌 반구에 중간 선을 따라 대뇌를 나누고 이후 후각 전구, 기초 대뇌 피질 아래의 신경과 뒤몽 집게로 해마를 잘라. 얼음에 매체를 해부가 포함 된 깨끗한 페트리 접시에서 고립 대뇌 피질을 놓습니다. 하나 피질을 가져 가라. 해부 현미경 미세 팁 포셉으로 수막을 제거합니다. 나머지 피질과 반복합니다. 얼음에 한 깨끗한 페트리 접시에 모든 수막없는 피질를 놓습니다. 60mm 페트리 접시에 모든 새끼에서 대뇌 피질 반구를 결합하고 조각을 다진 1mm로 뇌 조직을 주사위하기 위해 멸균 면도날을 사용합니다. 멸균, 코팅 된 500ml의 유리제 플라스크에 10 ㎖ 피펫을 사용 다진 뇌 조직을 옮기고 쥐 뇌 당 빙냉 해부 배지 10 ㎖를 추가한다. 쥐의 뇌 당 HBSS 9 ml의 HBSS (행크의 균형 소금 솔루션) (5 ㎎ / ㎖ 트립신)에 트립신 용액 1 ㎖를 추가하는 동안 조심스럽게 플라스크를 소용돌이 친다. 2 추가의 DNase I 용액 (1 ㎎ / ㎖) 및 황산 용액의 총 부피의 2 %의 총량의 % (HBSS에서 3.82 % 황산 (W / V)) 뇌 조직의 현탁액에 천천히 소용돌이 친다. 37 ºC에서 30 분 동안 회전 진탕 기에서 진탕하에 부드러운 티슈를 Trypsinize. 확인 조직 조각이 단계에서 부동하고 아래로 침전되지 않도록합니다. 필요한 경우 회전 속도 증가. 10 % (v / v)의 최종 농도의 소 태아 혈청 (FBS)를 첨가하고, 10 초 동안 10 번 플라스크를 소용돌이에 의해 혼합한다. 15 분 동안 얼음물에서 조직 현탁액을 냉각. 소용돌이 부드럽게 다섯 번 매초마다 분 플라스크. 조심스럽게 200 XG 4 ºC에서 5 분 동안 25 ㎖ 또는 50 ㎖ 피펫 원심 분리기를 이용하여 50 ㎖ 멸균 된 튜브에 조직 현탁액을 전송. 0.4 ml의 황산 용액을 뜨는을 취소하고 부드럽게 (15) 소 태아 혈청을 5 ml의 보충 얼음처럼 차가운 해부 매체의 ml의 소화 CNS 조직을 재현 탁 (3.82 %HBSS에서 황산)과의 DNase I (1 ㎎ / ㎖)을 1.6 ㎖의. 두 멸균 15 ㎖의 튜브에 균등하게 분할 조직 현탁액 (~ 10 씩으로) 천천히 정지가 혼탁 / 우유 빛이 될 때까지 10 ml를 피펫 (10 회)를 사용하여 씹다. 다음 튜브를 처리하는 동안 얼음에 중단 세포를 유지합니다. 소화 CNS 남은 튜브의 바닥에 침전물을 어떤 조직이 될 때까지 3 분 동안 기다립니다. 전송 상등액을 펠렛 분획을 방해하지 않고 50 ML 튜브를 청소합니다. 선택적으로, 40 마이크론 셀 스트레이너를 통해 혼탁 한 상층 액을 통과하고 얼음에 멸균 50 ㎖ 튜브에 생성 된 단일 세포 현탁액을 결합한다. 200 XG 4 ºC에서 5 분 동안 세포 슬러리를 스핀. 매체를 해부의 ~ 2 ml의 세포 펠렛의 상단에 남을 때까지 조심스럽게 10 ML의 피펫을 사용하여 상층 액을 제거합니다. 50 ㎖ 튜브 (~ 10 배)에 손가락 영화 세포 펠렛. 서서히 가온 성장 배지 5 ㎖를 추가 세포 현탁액하면서 부드럽게 (표 1 참조)손으로 튜브를 소용돌이. 선택적으로, 눈에 보이는 조직 클러스터 또는 DNA 덩어리의 경우 신선한 DNase의의 I 용액과 황산 -solution 얼음에 추가로 10 분 동안 DNase의 단계 4.3.12를 반복합니다. 소용돌이 튜브 수동 5 회 초마다 분. 접시 50,000 6 웰 접시에 400 ㎕의 성장 배지의 웅덩이 25mm 유리 커버 슬립 당 세포와 세포를 세포 배양 용 인큐베이터 (5 % CO 2, 37 ° C)에서 30 분 동안 부착하자. 합류를 들어 (24 내 – 48 도금 후 시간) 60mm 세포 배양 요리와 75cm 두 조직 문화 플라스크, 판 50 세포 (60mm 접시) 또는 2 백만 세포 (75cm 2 플라스크). 조심스럽게 2ml를 추가 (당 물론, 25mm 커버 글라스 6 잘 접시), 3 ㎖ (60mm 요리) 또는 각 따뜻한 성장 배지 10 ㎖ (75cm 2 플라스크)이 아니라. 하룻밤 세포를 품어 다음날 아침 매체를 완전히 변경합니다. 다음 중 매일 (등 3 일, 5 일, 하루 7)로 변경합니다. 아니테 : – 48 시간 도금 후 쥐 혼합 된 아교 세포 배양은 24 면역 세포 화학 또는 생화학 사용할 준비가 된 것입니다. 마우스 혼합 폐해 문화 4.3.1 4.3.6에 절에 설명 된 신생아 쥐 뇌의 해부, C57 / BL6 배경으로 P0 신생아 WT와 NCAM KO 마우스의 목을 벨의 머리를 제거하고 얼음처럼 차가운 해부 매체에 넣어 동일합니다 (표 1 참조). 항상 얼음에 조직을 유지합니다. 두 대뇌 반구에 중간 선을 따라 대뇌를 나누고 이후 후각 전구, 기초 대뇌 피질 아래의 신경과 뒤몽 집게로 해마를 잘라. 얼음에 HBSS를 포함하는 깨끗한 페트리 접시에서 고립 대뇌 피질을 놓습니다. 하나 피질을 가져 가라. 해부 현미경 미세 팁 포셉으로 수막을 제거합니다. 나머지 피질과 반복합니다. 얼음에 한 깨끗한 페트리 접시에 모든 수막없는 피질를 놓습니다. 대뇌 피질의 hemisphe 이동별도의 멸균 15 ㎖의 튜브에 각 마우스에서 1 ml를 피펫으로 입술. 각각의 뇌에 1.2 ml의 얼음처럼 차가운 해부 매체를 추가하고 기계적으로까지 그 2 번 피펫 팅에 의해 1 ML의 피펫 팁을 사용하여 아래로 뇌 조직을 방해. 150 ㎕를 파파인 솔루션 (PBS에서 10 ㎎ / ㎖), 100 μL의 DNase I 솔루션 (HBSS 1 ㎎ / ㎖) 및 각각의 뇌에 50 μl의 황산 (HBSS의 3.82 %)를 추가하고 손가락으로 쓸어 넘겨 섞는다. 수욕에서 37 ºC에서 30 분 동안 뇌 서스펜션을 품어 뇌 현탁액을 손가락으로 쓸어 넘겨 초마다 분을 섞는다. 튜브 당 FBS의 1 ML을 추가 혼합하고 얼음에 10 분 동안 조직 현탁액을 냉각. 200 XG 4 ºC에서 4 분 동안 뇌 조직을 스핀 다운하고 황산에게의 DNase I 용액 70 μL (1 밀리그램 / HBSS에서 ㎖) 30 ㎕를 보충 빙냉 해부 완충액 1 ㎖에서 4 해결책 티슈 펠렛을 재현 탁 (HBSS의 3.82 %). 하여 뇌 조직 씹다 FBS를 피복 한 ml의 피펫 팁(~ 5 배) 상등액 혼탁해질 때까지. 40 마이크론 셀 스트레이너를 통해 뜨는을 전달하고 얼음에 깨끗한 튜브로 전송할 수 있습니다. 200 XG 4 ºC에서 5 분 동안 원심 분리를 통해 혼합 교세포 펠렛. 매체의 대기음 뜨는 100 ~까지 μL은 세포 펠렛의 상단에 남아 있습니다. 손가락 튕기 (~ 5 배) 따뜻한 마우스 성장 배지 1 ㎖를 추가하여 재현 탁 된 세포 펠렛 (표 1 참조). 선택적으로, 눈에 보이는 세포 클러스터와 용해 세포를 용해 / 부드럽게 아래로 세포 현탁액의 위 (다섯 번) 피펫 팅하여 DNA를 침전. 4.3.21 – PDL 코팅 된 커버 글라스 또는 60mm 요리 접시 마우스 혼합 된 아교 세포 단계 4.3.19에 설명 된대로. 따뜻한 마우스 성장 매체 및 이후 매일과 다음날 아침 세포를 씻으십시오. 도금 후 72 시간 – 마우스 혼합 된 아교 세포는 면역 세포 화학 (48)에 대해 사용할 수 있습니다. 쥐 미세 아교 세포 분리 문화 쥐 혼합성장 배지에서 75cm 2 조직 배양 플라스크에서 신경교 10 일 (표 1 참조). 1 시간 동안 140 rpm에서 세포 배양 인큐베이터 (5 % CO 2, 37 ° C) 내부의 회전 진탕 기에서 혼합 된 아교 문화 소교 세포 클러스터를 흔들어. 혼합 아교 ​​세포 배양에서 미세 아교 세포 함유 뜨는을 벗고 40 마이크론 셀 스트레이너를 통해 전달하고 멸균 50 ㎖ 튜브에 세포 현탁액을 유지합니다. 참고 : 소교 문화가 몇 오염 개 OPC와 거의 성상이 단계 이후에 일반적으로> 95 % 순수입니다. 선택적으로, 미래 소교 흔들림 오프에 대한 혼합 된 아교 세포 배양에 성장 매체를 교체합니다. 일반적으로 혼합 폐해 문화에서 (한 번 주당) 여러 소교 흔들림 오프를 수행합니다. 선택적으로, 순도 95 % 이상 판을 100mm 배양 접시 당 미세 아교 세포 – 함유 상등액 (단계 4.5.2) 10 ㎖를 얻을 37 ºC에서 30 분 동안 세포 배양기에서 배양. 만 microgl성상 교세포와 개 OPC가 뜨는에 남아있는 동안 아이오와는 배양 접시에 부착됩니다. 천천히 시계 방향과 반 시계 방향으로 세포 배양 후드 (오 회)를 배양 접시를 흔들. 흡 인물 세포 배양 배지는 완전히 성장 배지 10 mL로 교체한다. 결과 미세 아교 세포 배양은 98 % 순수>입니다. DMEM에서 최대 7 일 동안 배양 된 미세 아교 세포는 1 % FBS와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충. 쥐 OPC / 희소 돌기 아교 세포 분리 매우 풍부한 OPC 문화가 1 시간 동안 140 rpm에서 세포 배양 인큐베이터 (5 % CO 2, 37 ° C) 내에서 회전 진탕 기에서 75cm 2 플라스크에서 재배 10 일 이전 혼합 폐해 문화에서 처음으로 미세 아교 세포를 떨쳐 구하십시오. 미세 아교 세포 만 함유 뜨는을 폐기 또는 미세 아교 세포 관련 실험 (단계 5.5 참조) 사용합니다. 10 ml의 성장 매체와 소교 함유 뜨는을 교체하고 대한 혼합 된 아교 문화를 떨쳐200 RPM (5 % CO 2, 37 ° C)의 회전 진탕 기에서 또 다른 18 시간. 혼합 된 아교 세포 배양에서 microglia- 및 OPC 함유 뜨는을 수집하고 40 마이크론 셀 스트레이너를 통해 전달합니다. 멸균 50 ㎖ 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다. 선택적으로, 미래의 OPC 흔들림 오프에 대한 혼합 된 아교 세포 배양에 성장 매체를 교체합니다. 참고 : OPC를 낮은 금리로,이기는하지만, 성상 세포 피더 레이어에 증식을 계속 흔들어 오프 할 수있는 두 번째와 세 번째 시간 (일주일에 한 번). 판 microglia-과 100mm 배양 접시에 뜨는 OPC가 함​​유 37 ºC에서 30 분 동안 세포 배양 인큐베이터에서 부화 10 ㎖. 개 OPC와 성상 세포가 뜨는에 남아있는 동안 미세 아교 세포는 배양 접시에 부착됩니다. 천천히 시계 방향과 반 시계 방향으로 세포 배양 후드 (5 회)를 배양 접시를 흔들. 세포 배양 인큐베이터에서 한 번에 몇 개의 배양 접시를 꺼내 (미세 아교 세포는 애완 동물에서 빠지 시작됩니다쿨러 매체에 격렬하게 흔들 리 요리). 수집하고 50 ㎖ 튜브에 OPC 함유 뜨는을 결합한다. 선택적으로, 미세 아교 세포 관련 실험에 사용하기 위해 배양 접시에 배지를 추가합니다. 선택적으로, 더 OPC 준비에 미세 아교 세포의 정도를 낮추기 위해 새로운 배양 접시에 한 번 단계 5.6.5과 5.6.6를 반복 OPC 문화의 순도를 증가시킵니다. 250 XG, 4 ºC에서 5 분 동안 원심 분리기에서 농축 OPC 함유 상층 액을 스핀. 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음. 펠렛의 상단에 뜨는 3 ㎖를두고 손가락 긋기 (10 회)에 의해 개 OPC를 재현 탁 시작합니다. (- 10 배 5) 10 ml를 피펫을 사용하여 천천히 씹다 OPC 세포 클러스터. 세포를 세어 6 웰 접시에 400 ㎕의 성장 배지의 웅덩이 25mm 유리 커버 슬립 (PDL은 코팅) 당 50,000 개 OPC를 접시에 세포를 세포 배양 인큐베이터에서 30 분 동안 부착하도록 (5 % CO 2, 376; C). 부드럽게 잘 각각에 따뜻한 증식 배지 (표 1 참조) 2 ㎖를 추가합니다. 증식 배지 3 ㎖에서 150 만 개 OPC -를 들어 60mm 세포 배양 용 접시, 플레이트 (1)를 PDL 코팅. 조심스럽게 OPC를 도금 후 신선한 확산 매체 3 시간으로 확산 매체를 FBS가 함유 교체 (제대로 연결 확인 개 OPC을 중간 변경시 꺼 내려하지 않음). 교환 매체마다 두 번째 날. 참고 : 마우스 OPC 배양은 일반적 성상 다음 주요 오염 세포 유형으로 미세 아교 세포와 90 % 순수이 프로토콜을 사용하여 제조. 기본 폐해 세포에 HIgM12 사용 5. 면역 세포 화학 HIgM12, 안티 PSA 단클론 항체 및 세포 유형 WT와 NCAM KO 마우스에서 기본 폐해 세포에서 특정 마커를 사용하여 트리플 라벨 면역 형광 생균 조건에서 라벨 60 % 융합 성 마우스 PDL 피복 성장 NCAM WT 및 KO 마우스로부터 신경교 배양 혼합HIgM12 (10 μg의 / mL) 및 PBS에서 안티 PSA 단클론 항체 (클론 2-2B) (10 μg의 / ㎖)와 25mm 커버 글라스를 30 분 동안 4 ºC에서 10 % FBS로 보충. 얼음처럼 차가운 PBS로 각각 10 % FBS와 보충 20 초 동안 세포를 세 번 세척하고 25 ºC에서 15 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드, pH를 7.4로 수정합니다. PBS로 각각 10 % FBS와 보충 1 분 동안 고정 된 세포를 두 번 세척하고 25 ºC에서 2 분 동안 PBS, pH를 7.4에서 0.1 % 트리톤 – X100과 세포를 Permeabilize 하시려면. 추운 방에 4 ºC에서 하룻밤 10 % FBS와 보충 1 분 동안 두 번 세포를 씻어 폐해 마커 GFAP (성상 세포) 또는 PBS에서 IBA-1 (미세 아교 세포) (1 μg의 / ml)로 레이블입니다. 매체 (31)를 장착 DAPI이 함유을 포함한 표준 면역 상태를 계속 진행합니다. 참고 : 사용의 형광 인간 2 차 항체 (HIgM12)와 마우스 (안티 PSA 단클론 항체, 클론 2 – 2B)로 팹 2 조각을 표시 IgMs이 좋습니다. FL을60X 또는 100X 배율에서 uorescent 이미지. 동일하게 모든 이미지 및 프로세스 이미지에 대해 동일한 장비 설정을 사용합니다. 차 항체로 HIgM12를 사용하여 엔도-NF-처리 WT 아교 세포의 면역 형광 라벨 로 Neurobasal (A)에 3 일간 성장 문화 WT 마우스 혼합 아교 ​​세포는 PDL 코팅 25mm 유리 커버 슬립에 10 % FBS와 B27 보충제 (1시 50분)로 보충. 1 ml의 배양액에 ENDO-NF (30 μg의 / ㎖)를 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에서 밤새 배양한다 (37 ℃, 5 % CO 2). 5.1.1 5.1.5에 단계에 설명 된대로 라벨 세포는 HIgM12과 고정 및 permeabilization 후 내부 성상 세포 마커 GFAP와 추위에 살고 있습니다. 60X 또는 100X 배율에서 형광 이미지를 가져 가라. 모든 이미지에 동일한 장비 설정을 사용하여 동일하게 처리합니다.