الاستراتيجية غشائي أنبوب خلية تشكيل الفحص: مقارنة خارج الخلية مصفوفة وعامل نمو مخفض خارج الخلية مصفوفة
Summary
This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.
Abstract
Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient’s blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.
Introduction
من أجل الحصول على العناصر الغذائية الضرورية للبقاء على قيد الحياة، تتطلب الأورام الخبيثة الوصول إلى مجرى دم المريض. للحصول على هذا الوصول، والخلايا السرطانية تفرز الإشارات الكيميائية التي تحفز نمو أوعية دموية جديدة إلى الورم، وبالتالي اختطاف عملية فيزيولوجية طبيعية تعرف باسم الأوعية الدموية 2. بل هو أيضا من خلال الأوعية الدموية التي تم إنشاؤها عن طريق الأوعية الدموية التي الانبثاث (أي انتشار السرطان إلى أعضاء أخرى) يمكن أن يحدث. لأن عملية تكوين الأوعية الدموية مسألة حيوية جدا لتطور هذه مجموعة واسعة من السرطانات، فمن هدفا جذابا في مجال البحوث العلاج المضادة للسرطان 3.
واحد الطريقة المستخدمة لتحديد الأوعية الدموية لقياس قدرة الخلية الاصلية البطانية لتشكيل الأنابيب عند وضعه على المصفوفة خارج الخلية. لأن تشكيل هذه الأنابيب هو خطوة حاسمة مبكرة في الأوعية الدموية، واختبار الظروف البيئية (على سبيل المثال، وجود أو عدم وجود التعاون نظرايوفر mpound) التي يمكن أن تحفز أو منع تشكيل أنبوب نظرة ثاقبة الخطوات المحددة التي يمكن أن تستهدف تمنع تكوين الأوعية الدموية. والبطانية أنبوب خلية تشكيل الفحص هي واحدة من الأكثر استخداما على نطاق واسع 4 طرق في المختبر الذي يقيس قدرة الخلايا على تشكيل الأنابيب. وهو فحص بسيط، الأمر الذي يتطلب عددا قليلا نسبيا من المكونات وفترة قصيرة ثقافة 5. ولعل الأهم من ذلك، ومع ذلك، هو أن البيانات المكتسبة من هذا النوع من الاختبار هو قياس الكمي.
مثال لاستخدام مقايسة تشكيل أنبوب ينطوي على مقارنة التطورات أنابيب من خلايا بطانة الأوعية الدموية نمت على المصفوفة خارج الخلية مقابل عامل النمو انخفاض (GFR) المصفوفة خارج الخلية. المصفوفة خارج الخلية هو الطابق السفلي يشبه الغشاء مادة معزولة من خلايا الورم اللحمي والمكونات الرئيسية هي laminin، النوع الرابع الكولاجين، عوامل النمو والبروتيوغليكان. بعض المركبات لها تأثيرات مختلفة على قدرة الخلية على شكل أنابيب عندما تكون فيبيئة مع عوامل النمو المنخفض وانخفاض بروتيوغليكان كبريتات heparan (HSPGs). HSPGs هي عنصر من عناصر المصفوفة خارج الخلية التي خفضت بشكل ملحوظ في معدل الترشيح الكبيبي المصفوفة خارج الخلية. على سبيل المثال، إذا كانت الفرضية هي أن مثبطات تكوين الأوعية الدموية، مثل SB225002، التي تمنع مستقبلات CXCR2، لديها قدرة أضعف إلى حد كبير لقطع تشكيل أنبوب عندما HSPGs وفيرة، ثم عقد مقارنة بين النشاط تشكيل أنبوب في المصفوفة خارج الخلية وGFR المصفوفة خارج الخلية هي المهم في استكشاف إمكانية تثبيط تكوين الأوعية الدموية عن طريق السيطرة على HSPGs.
المقايسات الأخرى التي تستخدم عادة لتحديد آثار المركبات على الأوعية الدموية هي في طرق الحي. الأمثلة البارزة على ذلك هي فرخ غشاء مشيمائي (CAM) فحص 6 باستخدام بيض الدجاج، وفي الجسم الحي Matrigel سد الأوعية الدموية فحص 7 باستخدام الفئران. بينما في الجسم الحي طرق قياس الأوعية الدموية في تيأبعاد hree وتكون أكثر تمثيلا للجسم البشري مقارنة في المختبر أنبوب تشكيل الفحص، فإنها تعاني من عيب تتطلب مزيدا من الوقت وهم إلى حد كبير أكثر صعوبة لأداء. كلا مقايسة كأم وفحص المكونات خارج الخلية تأخذ على الأقل في الأسبوع من 8 إلى القيام به، بينما في المقارنة، وفحص تشكيل أنبوب يمكن القيام به في يوم واحد، وأنها لا تتطلب استخدام الحيوانات.
من المهم أن نلاحظ أن الخلايا البطانية المستخدمة في هذا التقرير هي الوريد السري الخلايا البطانية الإنسان (HUVEC). هذه الخلايا تلعب دورا رئيسيا في تنبت الأوعية الدموية ونمو الأوعية الدموية، ومشابهة لالخلايا البطانية في السرطان ليتم استخدامها لتقييم النشاط المضادة للتكوين الأوعية الدموية في كل من في التجارب المختبرية والتجارب المجراة 9 بما فيه الكفاية. ويمكن أيضا خلايا أخرى مثل الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الابتدائية استخدامها.
ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن بالاضافة الى وجود أقلمستويات HSPGs، المصفوفة خارج الخلية GFR أيضا قد قللت من مستويات العديد من مكونات بالمقارنة مع المصفوفة خارج الخلية العادية. وهذا يشمل، ولكن ليس على سبيل الحصر: EGF، IGF-1، PDGF، وعامل النمو التحويلي بيتا. تلك التجارب أداء دراسة أهمية هذه المركبات فيما يتعلق الأوعية الدموية قد تكون مهتمة في استخدام GFR المصفوفة خارج الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
عند إجراء هذا الاختبار، فمن الضروري للحفاظ على المصفوفة خارج الخلية على الجليد أو على 4 درجات مئوية في جميع الأوقات ما لم ينص على خلاف ذلك. إذا سمح المصفوفة خارج الخلية لتدفئة فوق 4 درجات مئوية، وسوف بلمرة، وسوف تكون مدمرة للفحص. ومن المهم أيضا للتأكد من أن كل ما يأتي في اتصال (على سبيل المثال، نصائح الماصة، لوحة) مع المصفوفة خارج الخلية هي للسبب المذكور تبريد مسبقا. عدد الخلايا المزروعة في كل بئر أمر بالغ الأهمية، وعدد قليل جدا من الخلايا لا تعطي الويب المتوقع في العينة الضابطة، وعدد كبير جدا من الخلايا تشكل مجموعات الخلايا الكبيرة أو أحادي الطبقة وسوف الفحص لا تكون صالحة. عامل آخر مهم في نجاح هذا الاختبار هو عدد الخلايا مرور HUVECs. يجب أن يكون عدد مرور دائما أقل من عشرة، وإلا قد لا يحدث تشكيل أنبوب قوية. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي للمرء التأكد من أن مستنبت الخلية المستخدمة لم تنته، أو أن الخلايا لا تكون قابلة للحياة. Alternatively، يمكن للمرء أن قسامة على المديين المتوسط ومكوناته وتخزينها في -20 درجة مئوية إلى الحفاظ على لفترة من الزمن بعد تاريخ انتهاء الصلاحية. بطبيعة الحال، فإنه لا يزال الأفضل استخدام المتوسط قبل تاريخ انتهاء الصلاحية
مثل جميع الإجراءات، وهناك بعض العيوب لإجراء البطانية أنبوب خلية تشكيل الفحص. مشكلة واحدة كبرى هي أن، لأن هناك أنواع مختلفة من الخلايا البطانية والمصفوفات الدعم، ونتائج الفحص يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا تبعا الذي يستخدم نوع من الخلايا والمصفوفة. الخلايا البطانية المستخدمة (HUVECs، HAECs أو HMVECs) هي الخلايا الأولية، أنها مكلفة للحصول على ويكون التغير مقارنة مع الخلايا خلد. الخلايا الأولية لها ممرات محدودة للاستخدام، وبالتالي ليست مناسبة للتجارب الأوعية الدموية على المدى الطويل 14. للحصول على بيانات يمكن الاعتماد عليها، ينبغي للمرء دائما استخدام نفس أنواع للفحص. كما هو الحال مع البعض في فحوصات المختبر، وينبغي أن تكون نتائج الفحص تشكيل أنبوب يخدعترسخ في الجسم الحي، لأن النتائج من ظروف خاضعة للرقابة والاصطناعية من زراعة الأنسجة ثنائية الأبعاد قد لا يكون دائما تنعكس في عوضا عن الأكياس المعقدة للكائنات الحية. ومن المهم أيضا أن نأخذ في الاعتبار أن هذا النوع من الفحص يمكن أن تستخدم إلا لإثبات تشكيل أنبوب الخلايا البطانية، وينبغي ألا تستخدم لاختبار أخرى، غير البطانية، أنبوب تشكيل الخلايا.
هذا الاختبار هو طريقة بسيطة إلى حد ما وسريعة لتحديد إمكانية عائية من مركب. وهو يشكل أيضا منبرا لمزيد من التجارب، وحده، فإنه لا تعطي معلومات بشأن آلية معينة من خلالها مجمع يؤثر في الواقع عملية تشكيل السفينة. ومع ذلك، فإن استخدام مصفوفات خارج الخلية المتنوعة مثالا على كيفية مواصلة خلق إطار للأسئلة البحث التي لا تستخدم عادة. هناك أساليب لدراسة الآليات البيولوجية والكيميائية المحددة للمجمع بما في ذلك مثبطات محددة تستهدف مكوناتمسار الأوعية الدموية. قد تكون مقاربة أخرى لاستخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا البطانية واستخدام RT-PCR (في الوقت الحقيقي PCR) 12 لتحليل التغيرات في التعبير الجيني الذي قد يتسبب في سلوك النمو المسجلة في الفحص. وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذه الطريقة transfected HUVECs لخلق المقايسات تدق إلى أسفل إلى اتخاذ خطوات محددة لمسار الأوعية الدموية. وهناك إمكانية لتطبيق هذا النهج لدراسة مسار lymphangiogenesis. عن طريق تغيير مكونات المصفوفة خارج الخلية، والتفاعل من المصفوفة وعملية الخلوية دعم الأوعية الدموية في السرطان يمكن توضيحها بدرجة أكبر. استخراج الحمض النووي الريبي والبروتينات من الخلايا البطانية في ظل هذه الظروف محددة توفر البيانات الكمية الإضافية المقابلة لتصوير البيانات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was funded by the Fund for Medical Research and Education, Wayne State University, Detroit, MI.
Materials
| EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 ) | Fisher | NC9525043 | HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 oC, warm in 37 oC before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10mL; LDEV-Free | Fisher | CB-40230 | Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 oC , warm in 4 °C before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML ; 10mL; LDEV-Free | Fisher | CB-40234 | extracellular matrix, keep in -20 oC, warm in 4 °C before use. |
| SB225002 | Fisher | 559405 | CXCR2 inhibitor, keep in -20 oC, warm in room temperature before use. |
| Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ScienCell Research Laboratories | 8000 | culture it according reference 10. |
| Trypsin 0.05%-EDTA phenol red | Invitrogen | 25300-054 | keep in 4 oC, warm in 37 oC before use. |
| Nikon ECLIPSE Ti | Nikon | Inverted Research Microscope. | |
| NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit | Nikon | Inverted Research Microscope software | |
| Graph-pad Prism 5 | GraphPad Software, Inc. | scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50. |
References
- Sharma, B., Nawandar, D. M., Nannuru, K. C., Varney, M. L., Singh, R. K. Targeting CXCR2 enhances chemotherapeutic response, inhibits mammary tumor growth, angiogenesis, and lung metastasis. Mol Cancer Ther. 12 (5), 799-808 (2013).
- Birbrair, A., et al. Type-2 pericytes participate in normal and tumoral angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 307 (1), 25-38 (2014).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Speyer, C. L., Hachem, A. H., Assi, A. A., Johnson, J. S., DeVries, J. A., Gorski, D. H. Metabotropic glutamate receptor-1 as a novel target for the antiangiogenic treatment of breast cancer. PLoS One. 9 (3), 88830 (2014).
- Gu, X., et al. Human Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease siRNA Inhibits the Angiogenesis Induced by X-Ray Irradiation in Lung Cancer Cells. International Journal of Medical Sciences. 10 (7), 870-882 (2013).
- Manjunathan, R., Ragunathan, M. Chicken chorioallantoic membrane as a reliable model to evaluate osteosarcoma-an experimental approach using SaOS2 cell line. Biol Proced Online. 17, 10 (2015).
- Nidhyanandan, S., Boreddy, T. S., Chandrasekhar, K. B., Reddy, N. D., Kulkarni, N. M., Narayanan, S. Phosphodiesterase inhibitor, pentoxifylline enhances anticancer activity of histone deacetylase inhibitor, MS-275 in human breast cancer in vitro and in vivo. Eur J Pharmacol. 764, 508-519 (2015).
- Li, Y., et al. Copper improves the anti-angiogenic activity of disulfiram through the EGFR/src/VEGF pathway in gliomas. Cancer Lett. Aug. , (2015).
- Park, H. J., Zhang, Y., Georgescu, S. P., Johnson, K. L., Kong, D., Galper, J. B. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Rev. 2 (2), 93-102 (2006).
- de Wit, C., Fautz, C., Xu, Y. Real-time quantitative PCR for retrovirus-like particle quantification in CHO cell culture. Biologicals. 28 (3), 137-148 (2000).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells for derived from umbililcal veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
