Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter

I neutrofili sono i più abbondanti e di breve durata leucociti in circolazione. Essi stanno rapidamente reclutati per i siti di infezione o lesioni, dove servono fagociti come professionisti attraverso il rilascio di reattivi intermedi ossigeno e di azoto insieme con granuli contenenti peptidi antimicrobici e proteasi ^1. Durante il loro reclutamento, i neutrofili sono "innescato" da vari agenti compresi i prodotti microbici, chemoattractants, e citochine infiammatorie, con conseguente funzionalità dei fagociti nettamente migliorata all'arrivo in un sito di infiammazione ^2. I meccanismi di priming neutrofili sono state ampiamente studiate in vitro ^3,4; Tuttavia, il monitoraggio dinamico del processo in vivo non è stato possibile finora.

Recentemente, l'imaging intravitale è diventata una tecnica importante per la visualizzazione e quantificare le dinamiche cellulari di processi biologici degli organismi viventi. IntraviImaging tal può essere effettuato tramite convenzionale eccitazione microscopia one-photon (ad esempio, confocale) o multiphoton microscopia avvicina ^5. Nel corso del tempo, sostanziali miglioramenti sono stati raggiunti in questa tecnica che consente una maggiore risoluzione delle immagini, una maggiore profondità delle immagini, riduzione fotodanneggiamento del tessuto, e una maggiore ^6,7 stabilizzazione delle immagini. Data la sua capacità unica di consentire la visualizzazione dinamica di migrazione cellulare e l'interazione con il tempo, la microscopia intravitale è stato ampiamente applicato a diverse aree di studio in immunologia ^8. l'imaging intravitale consente immunologi di comprendere e contestualizzare le risposte immunitarie, sia a livello cellulare e molecolare in modelli animali vivere meglio.

I recenti progressi nella transgenici e knock-in topi reporter hanno fornito strumenti utili per il monitoraggio dei comportamenti dinamici di neutrofili negli animali viventi. Il lisozima M promotore-driven maggiore proteina fluorescente verde knock-ini topi sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare la motilità dei neutrofili, monociti e macrofagi durante i vari processi infiammatori tra cui stravaso, infezione batterica, e l'infiammazione sterile ^9-15. Inoltre, i topi transgenici che esprimono una fluorescenza di risonanza di trasferimento di energia biosensore citoplasmatica sono stati impiegati nello studio delle attività di neutrofili mitogeno chinasi extracellulare-regolamentato e la proteina chinasi A all'interno dell'intestino infiammato ^16. Un modello murino con alta specificità per l'espressione di fluorescenza nei neutrofili è il mouse Catchup knock-in, che produce Cre ricombinasi, nonche la tdTomato proteina fluorescente, che si è accoppiata espressione di linfociti antigene 6G (Ly6G) ^17. Visualizzazione dei neutrofili Ly6G-deficienti attraverso questo modello ha dimostrato che queste cellule esercitano funzionalità normale in una varietà di contesti infiammatori vivo sterili o infettive. topi transgenici che esprimono la DsRed fluorescente protein gene sotto il controllo del mouse interleuikin-1β (IL-1β) promotore (pIL1-DsRed) sono stati utilizzati per visualizzare i comportamenti motilità delle cellule che producono IL-1b – ritenuto includere neutrofili, monociti infiammatori e macrofagi attivati ​​- emergente in pelle infiammata ^18.

In vivo etichettatura può servire come un approccio alternativo per tracciare i comportamenti cellulari e molecolari di neutrofili nei tessuti infiammati. Dopo l'iniezione endovenosa di basse dosi di fluorescente anti- Gr-1-anticorpo monoclonale (mAb), la cascata reclutamento di Gr-1 ⁺ neutrofili è stata visualizzata in lesioni cutanee topo con infezioni da Staphylococcus aureus ^19. Somministrazione in vivo di coniugati contenenti streptavidina coniugati 705 nm punti quantici e biotinilato anti-Ly6G mAb etichetta specificamente neutrofili circolanti ^20. Inoltre, endocitosi di tali coniugati in neutrophIL vescicole permette il monitoraggio del trasporto delle vescicole ad alta velocità nei neutrofili migrano nell'interstizio. In vivo etichettatura con anticorpi fluorescenza coniugato contro P-selectina glicoproteina ligando-1 (PSGL-1), L-selectina (CD62L), integrina αM (CD11b ) e chemochine (CXC motivo) recettore 2 (CXCR2) in un modello infiammatoria TNF-indotta ha chiarito i meccanismi di regolazione in gioco durante l'infiammazione precoce ^21. neutrofili polarizzati sporgono uropodi PSGL-1-arricchito di interagire con CD62L presenti sulle piastrine attivate, con la conseguente ridistribuzione di CD11b e CXCR2, recettori che guidano la migrazione dei neutrofili e avviano l'infiammazione.

IL-1β è uno dei geni di firma che è elevata in neutrofili innescato ^22. In topi reporter pIL1-DsRed, segnali di fluorescenza DsRed (es., L'attivazione del promotore di IL-1β) correlano positivamente con IL-1β mRNA espressione e la produzione di proteine ​​di IL-1β. <sup> 18 per monitorare il processo di neutrofili adescamento, un metodo di microscopia intravitale è stato sviluppato coinvolgendo l'induzione di infiammazione della pelle con oxazolone (OX) nel modello murino pIL1-DsRed seguente etichettatura in vivo dei neutrofili con fluorescenza coniugato anti-Ly6G mAb. Attraverso questo modello, è possibile studiare il comportamento e la funzione dei neutrofili innescato in modelli animali di varie malattie e disturbi.