ניטור אופטי של תיוג מסוף העצב חיים זקיק השיער אזמלי Endings של<em> Ex Vivo</em> עור אוזן עכבר
Summary
Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.
Abstract
טכניקה לנתיחת הקלטת רומן מתוארת מכתים ניטור אופטי מכתים דה מסופי האזמלים סביב זקיקי שיער בעור של אפרכסת אוזן העכבר. ההכנה היא פשוטה ומהירה יחסית, מניב באזורים נרחבים מהימן של מספר יחידות שכותרתו מחיה מסוף העצב ללמוד ספיגה ושחרור של צבעי פירידיניום styryl בשימוש נרחב במחקרים של מחזור שלפוחית. לחלק את ההכנות לפני התיוג מאפשר בדיקה לעומת השוואות מלאות באותה אוזן מאדם יחיד. עצות מועילות ניתנות לשיפור האיכות של התכשיר, התיוג ואת פרמטרי ההדמיה. המערכת החדשה זה מתאים assaying פרמקולוגית מכנית הנגרמת ספיגת ושחרור צבעים חיוניים אלה מסופי אזמלי בשני wild-type ובעלי חיים מהונדסים גנטית. דוגמאות של השפעות modulatory על עוצמת תיוג מקבלים.
Introduction
קצות העצבים mechanosensory הם בדרך כלל קטנים, להפיץ מתפזרים וקשה גישה באתרו, כפי שהם בדרך כלל קבורים עמוק בתוך העור או הרקמות הסובבות אחרים. חזותי אותם, ולכן, בדרך כלל דורש חתך ואחריו immunolabeling ממושכת / תקופה מכתימה, או העיכוב והוצאות קבלת קווי עכבר עם ביטוי גנטי של תוויות ניאון כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק או צהוב (GFP / YFP) 1. כאן אנו מצביעים על רקמה נוחה שיטה מהירה ופשוטה כדי לקבל גישה למספר גדול של afferents זקיק שיער למחקר, וכיצד הם יכולים להיות מתויגים במהירות ניטור אופטי של מסוף פונקציה 2. בעזרת תרגול, את הטכניקה כולו מן לנתיחה כדי הדמיה ניתן להשלים קטנה כמו 2 שעות.
המסופים אזמלי של אקסונים חושי innervating זקיקי שיער אצל יונקי יוצרי Palisades ברחבי האפיתל של זקיק השיער, עם כלהמסוף הדחוק בין תאי גלייה / שוואן מעבד 2-4. מטרת המסוף היא לזהות תזוזה מכאנית של השערות הם מקיפים. הם תערובת של במהירות ולאט לאט סופים התאמה, אבל הם בעיקר לייצר צרורות קצרות של פעילות בתגובת תנועת שיער. בדרך כלל, ירי מפסיק מהר מאוד כאשר התנועה נפסקת, אפילו בנוכחות של עקירה המשיך.
פינה murine זה מודל ללימוד מסופי אזמלי בשיטות אופטיות יש תכונות רבות יתרון ללימוד המבנה והתפקוד של סופים אלה. אפרכסת האוזן היא בעיקר שתי שכבות של עור apposed גב אל גב, עם כמות קטנה בלבד של רקמת סחוס בין. העור הוא דק מאוד גזור בקלות בשל כמויות מינימאליות של יחסי רקמת חיבור דבקים בחולשה לאזורים אחרים בגוף. שכבות העור להפריד בקלות, ולכן, לתת גישה טובה הזקיקים והמסוף. העצבובנגיש וקל לזיהוי בקלות. זקיקי השיער הם יותר בדלילות מופץ מאשר באזורים אחרים לעור, הקלת ההדמיה של קבוצות בודדות או קטנות של זקיקים. שכבת הדרמיס הדקה הבסיסית נותנת נגישות טובה צבעים ותרופות פרמקולוגיים, כך הוא אידיאלי עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ללא עיבוד נוסף. ההדמיה של מסוף מסווג יכולה להיות מסוף חי או, אם באמצעות אנלוגי לצבוע לתקן, לאחר קיבוע ועיבוד היסטולוגית נוסף.
השתמשנו בתכשיר להראות הממברנה כי מיחזור מתרחשת סופים אזמלי, שמעידים ספיגת (אנדוציטוזה) ולשחרר (exocytosis) של צבע styryl פירידיניום (FM1-43; N – (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) dibromide פירידיניום). לצבוע לא, עם זאת, נראה לתייג את תא שוואן להשקיע מעבדת משמעותית 2. גם הראינו כי ספיגת צבע זה / שחרור, ומכאן קרום reCycling, כפוף אפנון glutamatergic דרך קולטן לגלוטמט (D מצמיד פוספוליפאז) הטיפוסי metabotropic. התוצאות של פרוטוקולי גירוי וניתוח פשוטים מומחשות, ונושאי ניתוח פוטנציאל משותפים גם מודגש.
Protocol
Representative Results
Discussion
במקור Bewick ו בץ פיתחה את N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) פירידיניום dibromide הקשורות צבעי styryl פירידיניום 7-10 לפקח המיחזור המקומי של קרום שלפוחית סינפטית. ספיג דיי, ומכאן קרינה גדלה, ולכן משקף הפנמת קרום שלפוחית סינפטית (אנדוציטוזה). בהמשך לכך, לצבוע הפנים זה יכול להיות שפורסמה מחדש על ידי פעילות חשמלית הלאה, מראה הפסד לצבוע מפקחת החצנת קרום שלפוחית (exocytosis). סינפסות, זה מה שמייצג הפרשת הנוירוטרנסמיטר. במקביל, מצאנו גם צבעים אלה תווית קצות עצבים mechanosensory עיקריים 7. לאחרונה 11, Bewick, בנקים ועמיתיו מכן הראו כי זה משקף תהליך דומה בוגרת, מסופי mechanosensory בדיל vivo לשעבר. הנה שוב, צבעים לתייג 50 ננומטר בקוטר 'הסינפטי דמוי' שלפוחית (ספקים חד-לשוניים) כי למחזר constitutively לשחרר גלוטמט.לכך במסופי mechanosensory, בניגוד לעמיתיהם סינפטיים שלהם, מחזור זה ספונטני בעיקר. זה הוא מווסת גם על ידי מכאני, ולא רק חשמל, גירוי.
עבור עצב סנסורי בתרבות בתאי השיער שבלול, צבעי styryl ב לצבוע פירידיניום בכלל styryl בפרט הוכחו לעבור בצינורות mechanosensory, חסימת ערוצי mechanosensory ובאופן בלתי הפיך תיוג ממברנות פנימיות 12. עם זאת, בריכוזים דומים לצבוע styryl במסופי mechanosensory בדיל באתרו, כמו כאן סופים אזמלי 2, או סופי Ia ב כישור שריר 11, ו בתאי שיער שאינם מגורים באופן מכאני 13, 14, תיוג הוא על ידי אנדוציטוזה הממברנה. לכך במסופי עצב mechanosensory, למשל, התיוג הוא הפיך ואינו חוסם את תגובות mechanosensory בריכוזים משמשים כאן 2, 11, 15. בעוד כמה הפנמה לצבוע ידי חלחול ערוץ הסופים אלה לא ניתן לשלול לחלוטין, destain כמעט המוחלטת עם latrotoxin מציינת את הרוב הגדול של התיוג במסופי בוגרת הוא על ידי הפנמה עם קרום שלפוחית מחזור. יש לנו, אם כן, השתמשתי בטכניקה זו כדי לחקור את תלות פעילות 11, ולאחרונה, הפרמקולוגיה 2 של מחזור SLV במסופים מביאים mechanosensory ידי בחינת שפעות תרופה על ספיגת שחרורו של הצבעים.
כמו ברוב טכניקות מעשיות, שחזור דורש חזרה ותרגול. כמה נקודות מפתח עבור הבטחה אמינה יידונו עכשיו. תיוג אזמלים בחי צעיר הוא אמין יותר – החיה הקטנה השתמשנו הייתה משקל גוף 15 גרם. זה לא לגמרי ברור מדוע זה מקרה, אבל זה יכול להיות בגלל דיסקציה של רקמת החיבור הצעירה דורשת טראומה מכאנית פחות leAves פחות הנותרים שאריות בעת הסרת רקמות שמעל שכבת העצבוב.
באופן כללי, הכנת הרקמה היא די פשוטה, עם קילוף שכבות העור מלבד היותו ההיבט המעשי המאתגר ביותר מבחינה הטכנית וגם אז רק עכברים מבוגרים. בשינה אלה שכבות העור לדבוק יחד בחום בבסיס שבו לנתיחה מתחילה, אך גם כאן הפרדת השכבות הופכת לקלה הרבה יותר לכיוון השולי. למרבה המזל, או אולי כתוצאה מכך, אזורי העור השוליים המדללים אלה בדרך כלל לתת התיוג משביע הרצון ביותר, כפי שעושה את העור הקדמי בדרך כלל. לכן, במיוחד להימנע לתפוס את העור מאוד דק בשוליים. כדי למזער את הסיכון לניזק, לתפעל הכנות בעקיפין על ידי דחיפה עם מלקחיים סגורים ולא האחיזה ישירות, או אם להיות מתויגות קשות לתפוס חיוני רק רקמות סבירות. להיות יסודי הסרת שכבת 'גיליון הקלקר' מייד שמעל הזקיקים, כמו זה האני הראשיחסימת chanical הדמיה וגישת תרופה. עם זאת, זה חיוני כדי למזער מגע פיזי עם מבנים בסיסיים כפיצויים זה (כלומר, רצועות ממנו) הרשתות העצביות ומסופים ממש מתחת. אם הקרינה השולטת היא צהובה / לבן בבלוטות החלב, קרינה אוטומטית הבולטת של בסיסי ההשערה כמה סהרוני קצים כתומים / צהובים אזמלים, זה מצביע על שכבת מקלעת עצבים ומסופי האזמלים קשורים הוסרו במהלך פינוי. זו כנראה הבעיה העיקרית עם מבוגרים (> 30 גרם) עכברים. לאורך כל ההליכים המכתימים, לוודא שהכל הוא על 30 מעלות צלזיוס היטב מחומצן. עליך להיות מודע לכך מסופי שכותרתו הם עדיין בחיים. כתוצאה מכך, לצבוע יהיה מופרש על ידי שחרור exocytic ספונטני מתמשך (מכונן). זה יהיה איטי יותר ב- R / T, אבל זהו תרגול טוב כדי למזער את העיכוב בין הסרת פתרון chelator והדמיה, כדי להקטין את איבוד הצבע. יתר על כן, עבור בין-קבוצות של השוואתיtudies של אינטנסיביות, זה הכרחי כדי להבטיח הדמיה של כל הקבוצות היא בהתאמה זמן. שימוש סוכן צבען chelating לפני ההדמיה משפר באופן משמעותי לעומת תמונה. כך, בעוד יקר יחסית, צעד קלאציה הוא די חשוב להבטחת איכות תמונה טובה. ניתן למזער שימוש chelator על ידי שימוש חוזר הפתרון מספר פעמים, ואף על 2 – 3 ימים רצופים, אם מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בין השימושים. מחק את פתרון chelator פעם זה הולך ורוד ניכר, מראה קיבוע הצבע שלה מתקרב לרוויה.
במהלך הדמיה, להיות מודעים לפוטנציאל עבור נזק phototoxic מסופי חיים אלה, שהינה תוצאה מצטברת של שני האינטנסיביות ואת זמן החשיפה של האור עירור. שיקול זה הוא פחות חשוב עבור תמונות timepoint היחיד, שבו איכות התמונה היא הדאגה העיקרית. עם זאת, חשוב במהלך ההדמיה חזרה במחקרים קינטיקה להפחית עירור חשיפה לאור למינימום. תוך פיתוח צבעים אלה כדיסינפסות תווית, מצאנו עירור עבור> 1 דקות ב תאורה עירור מלוא העוצמה תגרום נזק דרמטי בלתי הפיך מסופי העצב. הם ראשונים ובהמשך מרחיבים עצום, ואז להתמוטט לחלוטין על פני תקופה של ~ 15 דק '. אנחנו באופן שיטתי לא בודקים את התרומה היחסית של זמן חשיפה ועוצם, אך תצפיות אלה מראים העיקרון המנחה צריך להיות כדי למזער את שניהם. אז, מומלץ כי עירור אור עוצם ומשך הם המינימום בקנה אחד עם מקבל תמונות טובות, ותמונות בקרה נאותות נלקחות במחקרי זמן כמובן. כדי לבדוק שהנתונים אינם מושפעים phototoxicity בתנאי הדמיה חוזר ונשנים, בכל נקודת זמן לקחת תמונה נוספת של טרמינל בעבר שלא נצפה. זאת על מנת להבטיח את התנהגותם של התיוג במסופים נאיביים דומה לזו בזקיקים להיות הדמיה שוב ושוב.
מספר גורמים יכולים להפחית את ההשתנות בתוך הקבוצה של ד העוצם נטואתא. מיקום מדויק של ROIs, במיוחד את ההחזר על ההשקעה רקע, חשוב, כמו גם אזורים קטנים של מכתים הולם יכול להשפיע בין-זקיק מאוד השתנות הנתונים. ההשתנות של עוצמת נטו גם מושפעת כיצד לחלוטין כל זקיק שיער מוקף המשוכה של הסופים. השוואה למשל, חלוקת תיוג בצורה חצי הסהר באיור 1B עם הדפוס כמעט לחלוטין עגול שניתן לראות באיור 2. ניתוח מורכב יותר, אולי באמצעות זיהוי תוכנה אוטומטיים thresholding, נחוצה אם מידת הכיתור היא פרמטר רלוונטי. שים לב כי ההפצות בעצמה אפילו קבוצות הזקיק נתחו בצורה המדויקת ביותר אינן מתחלקים בדרך כלל (ראה איור 3), דבר המחייבות את השימוש בסטטיסטיקה הלא פרמטרית להשוואות בין-הטיפול של חציוני אוכלוסייה ולא אמצעי. טכניקות נורמליזציה, כגון לבטא עוצמות כמו o אחוזשליטה נגדית f, או של קבוצת ביקורת מורכבת הכנות כמה, ניתן ליישם כדי להפחית עוד יותר השתנות. הפריט הטכני הסופי שיש לקחת בחשבון הוא תכנון הניסוי לבדיקה תרופתית. במהלך חקירות תרופתיות, טרום דגירה הכנה בפתרון תרופה למשך 30 דקות לפני יישום צבע. לאחר מכן, לשמור על ריכוז התרופה בתמיסת הצבע. בשינה שולטת, השתמש באחת מלוח או, אם התרופה מומסת רכב, מלוח פלוס רכב.
המאמר הנוכחי מדגים כיצד הכנה פינה חדשה זו מציעה תמונות באיכות גבוהות של סופי mechanosensory בעור עם הכנה מינימאלית. אנחנו גם להראות את זה יכול לשמש כדי לבחון את פרמקולוגיה של שני היבטים קריטיים של מחזור שלפוחית. אנחנו מראים הראשון אגוניסט קולטן הגלוטמט יכול להגדיל הפנמה לצבוע (סמן של אנדוציטוזה), ושנית, לצבוע, כי הוא איבד שוב עם latrotoxin (ממריץ של exocytosis). המשמעות של preparat זהיון וטכניקה הוא שהיא מציעה גישה מצוינת לחי מסופי mechanosenory עור באתרו לניסויי הדמיה, ונותן הזדמנויות ייחודיות עבור ניטור אופטי של פונקצית מסוף, מבנה-היחסים בין שלהם. לשם אחרון זה, פתחנו גם אותו עוד יותר לשימוש במחקרים אופטיים / אלקטרו משולבים (ראה מאמר יופיטר אחות לפרטים נוספים).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה מומנה על ידי מענק G0601253 הפרויקט המועצה למחקר רפואי בבריטניה GSB ו RWB ומענק SULSA Bioskape כדי GSB
Materials
| PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Andres, K. H. On the microstructure of receptors on sinus hair. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 75, 339-365 (1966).
- Shenton, F., Bewick, G. S., Banks, R. W. A study of the expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK1-3) in sensory endings of muscle spindles and lanceolate endings of hair follicles in the rat. PLoS One. 9, e107073 (2014).
- Liley, A. W. An investigation of spontaneous activity at the neuromuscular junction of the rat. J. Physiol. 132 (3), 650-666 (1956).
- Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 88 (10), 583-595 (2012).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S., Ridge, R. M. Intracellular movements of fluorescently labeled synaptic vesicles in frog motor nerve terminals during nerve stimulation. Neuron. 9 (5), 805-813 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. J. Physiol. 460 (1), 287-309 (1993).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Drew, L., Wood, J. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22 (10), 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Physiol. Soc. 21, P22 (2010).
