Un método simplificado para determinar la densidad ultra-baja, a largo plazo del hipocampo primaria Neurona Cultura

Cultivo de neuronas del hipocampo en condiciones in vitro permite la observación y la manipulación experimental de estas neuronas que de otra manera no son posibles en vivo. Este enfoque experimental es ampliamente utilizado para revelar los mecanismos neuronales de crecimiento, la polaridad, la especificación de neuritas, el tráfico y la localización subcelular de las proteínas, la formación de sinapsis y la maduración funcional ^1. Estos in vitro neuronas del hipocampo en cultivo, cuando se cosecha a partir de las últimas etapas embrionarias, son relativamente puro (> 90%) de las células glutamatérgicas de la morfología piramidal ^2. Debido a que las neuronas se cultivaron en una superficie de 2-D en condiciones in vitro, este método permite la observación fácil, tales como formación de imágenes en vivo o inmunocitoquímica (ICC) tinción a través de un único plano focal ^3; o manipulaciones, como el tratamiento de drogas y transfecciones ^3-6. Cuando se cultiva a alta densidad, las neuronas tienden a tener altas tasas de supervivencia a causa de una mayor cooperaciónncentrations de factores de crecimiento secretados además de apoyo alimentario a partir de los medios de crecimiento, y también debido a los mecanismos dependientes del contacto neuritas ^7. Sin embargo, las neuronas del hipocampo de baja densidad son deseables para los estudios morfológicos, donde una neurona individual se pueden obtener imágenes en su totalidad o teñido para el análisis de la CPI. Neuronas de baja densidad son difíciles de mantener en cultivo debido a la falta de apoyo paracrina y por lo tanto a menudo requieren soporte trófico de un glial (típicamente cortical astrocitos) capa de alimentación, que tiene que ser preparada antes del cultivo de las neuronas ^2. Cuando se co-cultivaron con una capa de alimentación de células gliales, las neuronas de baja densidad se cultivan en cubreobjetos, y luego da la vuelta en la parte superior de la capa de células gliales de modo que las neuronas de baja densidad y glia se enfrentan entre sí. Un pequeño espacio confinado entre la glía y las neuronas se crea mediante la colocación de puntos de cera de parafina en las esquinas de los cubreobjetos, por lo tanto la creación de un diseño de "sandwich" ^2,8,9. Las neuronas de baja densidad crecerán wentro del espacio confinado entre glia y el cubreobjetos, que crea un microambiente permisiva con factores concentrados secretadas por las neuronas y células gliales. Este enfoque produce baja densidad, las neuronas plenamente desarrollados que están espaciados aparte razonable, por lo tanto, facilitar el etiquetado de la CPI o estudios de imagen en vivo.

Un inconveniente evidente de co-cultivo neurona-glía, además de ser lento y laborioso, es que evita estudio de específicos de neuronas, o células autónomas, mecanismos. Aunque este sistema es mucho menos complejo que in vivo el tejido neural, células gliales impacto sobre el desarrollo de las neuronas a través de factores definidos, que aún no es totalmente segregadas pueden confundir a los experimentos ^10. Por lo tanto, en los experimentos que requieren la investigación de mecanismos específicos de neuronas, las condiciones de cultivo definidos que eliminar el suero y la capa de apoyo glial son necesarios. Un estudio previo ha tenido éxito en el cultivo de bajas concentraciones de neuronas (~ 9.000 células / cm ²⁾ usando un THmatriz de hidrogel dimensiones ree ^11. Desde una población neuronal relativamente puro puede cultivarse a alta densidad en condiciones libres de suero sin apoyo glial, que postula que ultra-baja densidad de neuronas del hipocampo se puede cultivar en suero libre definido medio de cultivo por los co-cultivo con las neuronas de alta densidad, en de una manera que es análoga a la neurona-glía co-cultivo convencionalmente adoptado. De hecho, la alta densidad de las neuronas del hipocampo culturas en una configuración de "sandwich" se han utilizado recientemente para apoyar a un pequeño número de neuronas magnocelular endocrinas especializadas ^12.

Por lo tanto, co-cultivo con las neuronas de alta densidad puede permitir que las neuronas de baja densidad que reciben apoyo factores tróficos que es suficiente para permitir la supervivencia a largo plazo. Este protocolo de neuronas ultra-baja densidad de cultivo fue así formulado y validado. El protocolo puede implementarse dentro de un único experimento, mediante la preparación de alta densidad (~ 250.000 células / ml) dislas neuronas del hipocampo no asociados primero, y luego hacer una dilución para producir una densidad de ~ 10.000 neuronas / ml (~ 3.000 neuronas / cubreobjetos, o ~ 2.000 neuronas / cm ^2), que es mucho más bajo que la mayoría informó de cultivos de baja densidad ^{2,3,9 , 11,13.} Esta condición se conoce la cultura libremente como cultura "ultra-baja densidad 'y se utiliza con" baja densidad "de manera intercambiable. Las neuronas de alta densidad se colocan en el poli-D-lisina placas de 24 pocillos recubiertas; mientras que las neuronas de baja densidad se siembran en cubreobjetos de vidrio de 12 mm recubiertos con poli-D-lisina que se colocan dentro de otra placa de 24 pocillos. Los cubreobjetos con adherir neuronas de baja densidad se da la vuelta en la parte superior de las neuronas de alta densidad 2 horas más tarde después de que las neuronas se descienden y se unen a los cubreobjetos. Además, en lugar de utilizar puntos de cera de parafina para elevar los cubreobjetos por encima de la capa de neuronas de alta densidad, se utilizó una aguja de jeringa de 18 G para grabar la parte inferior de las placas de 24 pocillos con dos franjas paralelas. El resultado MostrAced, plásticos adyacentes proporcionar un soporte elevado para los cubreobjetos de vidrio. Este espacio se mide constantemente a 150-200 micras, lo que permite suficiente intercambio de oxígeno y medio de cultivo al tiempo que proporciona un microambiente con factores tróficos concentradas. Bajo esta condición, las neuronas de baja densidad crecen mucho, y pueden sobrevivir más allá de tres meses en cultivo. Cuando estas neuronas son transfectadas con el plásmido GFP después de tres semanas de cultivo, las dendritas están profusamente salpicado de espinas dendríticas. Como prueba de principio, los datos se presentan para mostrar que este sistema de co-cultivo apoya culturas ultra-baja densidad de neuronas del hipocampo sembradas en poli-D-lisina 'micro-islas', donde las neuronas forman conexiones autaptic que pueden facilitar la investigación de células , mecanismos independientes de la red -autonomous.