Корковая актин расхода в Т-клетках количественно пространственно-временной корреляционной спектроскопии Изображение структурированных данных микроскопии Освещение
Summary
To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.
Abstract
Нитчатых актина играет решающую роль в большинстве клеточных процессов, включая моторику и, в иммунных клетках, формирование ключа взаимодействия клетка-клетка, известного как иммунологического синапса. F-актина также предположил, чтобы играть роль в регулировании распределения молекулярных на мембране клеток, включая суб-перепончатая динамики пузырька и белка кластеризации. В то время как стандартные методы световой микроскоп позволяют обобщенные и дифракционной наблюдения должны быть сделаны, многие клеточные и молекулярные события, включая кластеризации и молекулярного потока происходят в популяциях в длину масштабах намного ниже разрешающей способности стандартных световой микроскопии. Комбинируя общую флуоресценцию внутреннего отражения с разрешающей способностью супер метод структурированной подсветки микроскопии, двумерный молекулярная поток F-актина в иммунной синапса Т-клеток был записан. Пространственно-временная корреляция изображений спектроскопия (Stics), то применялась, который генерирует количественному РЕЗУЛЬТАТОВTS в виде гистограмм скорости и векторных карт, представляющих направленность потока и величины. Этот протокол описывает комбинацию изображений и Stics методов супер-разрешением, чтобы генерировать векторы движения на уровне суб-дифракционных подробно. Этот метод был использован для подтверждения, что поток актина симметрично ретроградной и центростремительных всей периферии Т-клеток при образовании синапсов.
Introduction
Цель эксперимента состоит в изображении и характеризуют молекулярный поток filamentous- (F-) актина в живых Т-клеток, за пределом дифракции для установления направления потока и величину во иммунологического синапса (IS) образование. Эта техника будет осуществляться с использованием структурированного освещения микроскопа (SIM) в полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) режиме, визуализации Jurkat Т-клетки, образующие искусственную синапс на покровные активации, покрытых анти-CD3- и анти-CD28 антител. ИС формы между Т-клетке и ее цели; антигенпрезентирующей клетки (АРС) при Т-клеточный рецептор (TCR) активации 1,2. Как это первый шаг в определении, создает ли адаптивной иммунной системы иммунного ответа на инфекцию, последствия неправильного реагирования на раздражители могут вызвать ряд заболеваний. Важность взаимодействия Т-клеток-APC хорошо документирована, однако, роль (ы) зрелого после первоначального TCR сигнал интернализация еще предстоит в полной мере понять.
Как цитоскелета, как полагают, помочь два процесса, связанных с TCR активации (движения молекул на плазматической мембране и контроля сигнальных молекул, зависящие от актина цитоскелета 3,4), понимание того, как цитоскелет перестраивается во времени и пространстве будет выяснить шаги молекулярной реорганизации в процессе формирования синапсов. Ретроградное поток F-актина, как полагают, загон TCR кластеров к центру иммунологического синапса, это перемещение, как полагают, важны для прекращения и утилизации сигнала; помогая прекрасный баланс активации Т-клеток 5.
В то время как стандартная флуоресцентная микроскопия представляет собой гибкий инструмент, который продолжает оказывать представление о многих биологических событий, включая межклеточных взаимодействий, она ограничена способность системы точно решить несколько флуорофоры проживающих ближе, чем diffrПредел действие (≈200 нм) друг от друга. Как и многие молекулярные события в клетках включать плотные популяции молекул и проявляют динамическую перестройку или в неподвижности или по специфической стимуляции, обычный световой микроскопии не обеспечивает полную картину.
Использование изображений сверхвысокого разрешения позволило исследователям, чтобы обойти дифракционный предел, используя различные методы. Локализация одной молекулы микроскопии (SMLM), такие как ладонь и STORM 6,7 имеет возможность разрешить расположение молекул до точности около 20 нм, однако, эти методы опираются на долгие времена приобретения, создания образа в течение многих кадров , Как правило, это требует образцы, которые фиксированные или структуры, проявляют низкую мобильность так одиночные флуорофоры не неверно истолкованы как нескольких точек. В то время как истощение стимулировали выбросов (STED) изображения позволяет супер-разрешение через очень селективного возбуждения конфокальной 8, требуется сканированияПодход может быть медленным в течение целых клеток, полей зрения. STED также демонстрирует значительный фототоксичность для более высоких разрешениях в связи с увеличением мощности обеднения пучка.
Структурированная подсветка микроскопии (SIM-9) обеспечивает альтернативу этим методам, способных удвоения разрешение стандартного флуоресцентного микроскопа и более совместим с живой клетки визуализации, чем современные методы SMLM. Он использует нижних лазерных полномочия, в системе широкого поля для цельноклеточных полей зрения; обеспечивая повышенную скорость приобретения, и совместим со стандартным флуорофора маркировки. Широкий поля природа SIM также позволяет использование полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) для высоко селективного возбуждения, с глубины проникновения в осевой размер <100 нм.
Корреляция изображения спектроскопии (ИКС) представляет собой метод корреляции флуктуации интенсивности флуоресценции. Эволюция ICS; Пространственно-временная имвозраст корреляционная спектроскопия (Stics 10) коррелирует внутриклеточные сигналы в люминесцентных времени и пространстве. Соотнося интенсивности пикселов с окружающих пикселей в отстающих кадров с помощью функции корреляции, информация о получила скоростей потока и направленности. Для обеспечения статические объекты не мешают анализу Stics, неподвижный объект фильтр реализован, который работает путем вычитания скользящей средней интенсивностей пикселей.
Методика представлена здесь, как полагают, первой демонстрацией изображения корреляционной спектроскопии применяется к данным микроскопии сверхвысокого разрешения для количественного определения молекулярного потока в живых клетках 11. Этот метод улучшает дифракционной томографии F-актина потока через Stics анализа 12 и подойдет исследователей, которые хотят, чтобы определить двумерную молекулярного потока в живых клетках, из данных, полученных в пространственным разрешением пределами дифракционного предела света.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод позволит исследователям изображения и количественно ранее неразрешимые детали в клетках, экспрессирующих флуоресценции. В наших результатов мы показываем, что F-актин потоков в симметричной моды из клеточной периферии к центру клетки в клетки Т. Эти данные согласуются с пр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada’s Discovery Grant program.
Materials
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
- Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
- Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).
