크기 배제 ICP-MS를 이용하여 정량적 Metalloproteomic 분석을위한 표준
Summary
Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma – mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.
Abstract
Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer’s and Parkinson’s disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma – mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.
Introduction
필수 금속은 보조 메신저 경로, 대사 경로와 세포 기관의 기능을 포함 정상적인 생물학적 기능에 중요한 역할을한다. 모든 단백질의 30 %가 금속 단백질 한 모든 효소 (2)의 50 %가 될 것으로 생각된다. Metalloenzymes는 화학 반응을 촉매하는 단백질 구조를 안정화하는 보조 인자로 및 보조 메신저 등의 규제 역할에 대한 이러한 미량 금속을 사용합니다. 신경 퇴행에 관해서 가장 공부 미량 원소 중 일부는 구리, 철, 아연 3입니다. 그들은 부정적인 영향을 가질 수있는 dyshomeostasis하여 많은 질병 경로에 관여하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 슈퍼 옥사이드 디스 무타 제 (SOD)에 직접적으로 영향을 수명 및 근 위축성 측삭 경화증 (ALS) (4) 가족 성 형태의 트랜스 제닉 마우스 모델 표현형의 금속 상태. 알츠하이머 질환, metalloproteomics 기술 P 트랜스페린에서의 금속 상태의 감소를 발견하는데 사용되어왔다lasma 5. 이 연구는 중요한 역할 금속 단백질이 질병에서 재생할 수 있습니다 강조 표시합니다.
직접 생체 조직에서 금속 단백질의 연구는 현상 필드입니다. 일부 metalloenzymes이 특징되었지만, 대다수는 아직 규명하지 않은 6 알 남아있다. 금속 단백질 측정의 주요 문제점 중 하나는 단백질 (7)의 기본 상태를 유지하기 위해 필요하다. 고전 상향식 프로테옴 기법 펩티드로 단백질 분해에 의존한다. 이 프로세스는 금속 및 단백질의 비공유 상호 작용을 방해. 따라서, 단백질의 금속 상태에 대한 정보가 획득되지 않는다.
질량 분석 8,9 (SEC-ICP-MS) – 이러한 문제를 극복하기위한 하나의 방법은 유도 결합 형 플라즈마와 짝을 크기 배제 크로마토 그래피를 사용하는 것이다. 이 단백질의 대략적인 크기에 대한 정보뿐만 아니라, ASSOC있는 모든 금속을 생성그것은 10 iated. 또한, 크기 배제는 효소 또는 단백질 – 단백질 복합체의 원시 상태를 유지 할 수있는 부드러운 크로마토 그래피 기술이다. 유도 결합 형 플라즈마를 사용하는 장점 중 하나 – 질량 분석법 (ICP-MS)는 기술의 정량적 인 특성이다. 금속 단백질 표준의 세트를 사용하여 생물학적 샘플에서 9,11 금속 단백질의 절대 정량을 제공 할 수있다. 이것은 금속의 농도의 범위에서 공지 된 금속 단백질을 주입하여 표준 곡선을 생성함으로써 달성된다.
이 프로토콜은 이것을 금속 단백질의 다양한 표준에 대해 달성 될 수 있는지의 일례를 나타낸다. 이 논문에서는 철 (Fe), 구리 (Cu), 아연 (Zn), 요오드 (I), 코발트 (Co)를 포함하여 주로 생물학적 분야에서 조사되는 금속의 표준 곡선을 작성하고자합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
단백질의 고유 상태를 보장하는 것은 사용 된 샘플의 저장이 필요한 버퍼들에 특별한주의를 의미한다. 모든 크로마토 그래피 기술 또는 시료 전처리 기술이 이용 될 수 없음. 이 샘플 준비 및 크로마토 그래피에서 사용되는 버퍼가 금속 킬레이트 및 생리 학적 pH와 염 농도를 모방 사용 버퍼없는 것이 중요하다. 피하기 위해 다른 조건은 가열에게 샘플 또는 단백질 변성제 (예를 들면, 요소)의 추가를 포함한다. 이 동결 해동 사이클의 수를 최소화하는 것이 중요하다. 가의 금속을 결합하는 선택 버퍼의 능력이 중요하다 트리스 또는 질산 암모늄 버퍼는 포스페이트 계 완충제 위에 선택되는 이유이다.
크로마토 다른 형태의 크기 배제 크로마토 그래피 상대적인 저해상도 피크 용량은 이러한 기술의 주요 제한된다. 크기 배제 chromatogra의 그러나, 부드러운 자연PHY는 단백질의 원래 상태를 유지하고, 따라서 비교적 약한 금속 – 단백질 결합을 유지하는 것이 중요하다. 단백질의 원래 상태를 유지하기위한 요구 사항은 금속 킬 레이터 (예 : EDTA) 또는 카오 트로픽 염 또는 세제 회피 동결 해동 사이클의 수를 제한을 포함하는 샘플의 치료에 특별한주의를 필요로한다.
이 기술의 영향이 낮은 해상도는 두 개 이상의 단백질을 포함 보이는 봉우리와 같은 복잡한 샘플에있는 경우 특정 단백질과 관련된 금속의 양을 정량화 할 수있는 능력. 따라서, 피크의 적분을 사용하여 결정 금속의 양은 모든 단백질은 단지 하나의 특정 단백질이 시점에서 용출되지와 연관된 금속의 총량의 표시 일 것이다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 관심의 단백질은 상기 기본 조건 하에서 정제되어야한다. 이것의 정량 허용이 단백질과 연결된 금속 certainity 높은 수준으로보고한다. 이 방법의 또 다른 잠재적 인 제한으로 인한 열 비 가역적으로 결합 단백질을 상실 할 것이다. 열 오프 용출 된 단백질의 양이 주입되는 양을 일치하는지 결정하기 위해 분석된다이 회복 실험이 발생하는 경우를 결정하기 위해 수행되어야한다. 동일한 용출은 물질의 금속 함량 및 벌크 ICP-MS에 의해 출발 물질을 측정함으로써 수행 될 수있다. 열 회수는 사용 조건에 따라 다를 수 있지만,이 크기 배제 칼럼으로부터의 단백질 전체 복구 9 가능하다고 밝혀졌다. 따라서, 사용되는 작동 조건에서 손실이 있는지의 여부를 확인하는 것이 중요하다.
프로토콜 수정 분석 요소뿐만 아니라 사용되는 금속 단백질 기준과 관련 될 수있다. 금속 단백질 표준 우리의 유형에드는 관심있는 요소에 따라 달라집니다. 이러한 구리, 철 및 아연 단백질 등의 요소를 들어, SOD 및 페리틴이 사용된다. 공지 stoichometries이 다른 금속 단백질도 사용할 수 있고, 몇 가지 예는 여기에 도시되어있다.
이 기술을 사용하여 발생할 수있는 하나의 주요 합병증은 ICP-MS의 성화에 소금 결정의 빌드 업입니다. 시스템을 통과 한 또는 육안에 의해 결정될 때 토치가 세정되어야한다는 완충액 1000 ml의 – 염 결정의 형성을 방지하기 위해, 토치 500 회 후 증류수로 세척한다. 발생할 수있는 또 다른 문제점은 시료 추출 콘의 청결도에 더 빠르게 감소한다. 이들은 제조 업체의 프로토콜 다음 정기적으로 청소해야합니다.
초기 샘플 준비 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. 금속 복잡한 INF – 단백질에 변경이있는 경우ormation이 유효하지 않습니다 생성합니다. 이 기술의 주요한 제한 사항 중 하나이고; 뿐만 아니라 저해상도의 사용은, 크기 배제 컬럼은 금속 단백질 생물학의 진정한 복잡성 제한된 상세도를 산출한다.
여기에 설명 된 기술은 생물체의 metalloproteome 지식의 확장을 허용한다. 벌크 분석은 시료 내의 금속의 양을 변화시켜 조 표시를 제공한다. 고려되어야 할 일반적인 고려 사항 외에도,이 기술은 얻어지는 트레이스와 비교하여 차이가 단백질뿐만 아니라 식별 금속 단백질과 연결된 금속의 양을 정량하기 위해 사용될 수있는 도구를 제공한다. 이 기술의 사용은 질환 상태의 차이를 식별하는 데 사용될 수있다. 식별 된 금속 단백질 후 더 그들은 질병 과정에서의 역할을 결정하는 데 도움을 조사 할 수 있습니다. 하이픈 ICP-MS의 적용은 증가를 가지고미래 약물 결합 단백질을 식별 할 수있는 예컨대 ICP-MS 등의 백금, 구리, 요오드 또는 헤테로이 약물의 역할을 결정한다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램 (애질런트)와 호주 연구 협의회 연계 프로젝트 계획, 정신 건강 및 Neuroproteomics에 대한 호주 국립 보건 의료 연구위원회, 빅토리아 뇌 은행, 협동 연구 센터의 지원을 인정하고 싶습니다 쉬움.
Materials
| Agilent 1290 Infinity Binary Pump | Agilent | G4220A | |
| Agilent 1290 Infinity Autosampler | Agilent | G4226A | |
| Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat | Agilent | G1330B | |
| Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316C | |
| Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector | Agilent | G1314E | |
| Agilent 7700 ICP-MS | Agilent | G3282A | |
| Ammonium hydroxide trace metal basis | Sigma | 338818 | |
| Ammonium nitrate | Sigma | 256064 | Make fresh 200mM solution on day of experiment |
| Antinomy | Choice analytical | 10002-3 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | ||
| Cesium | Choice analytical | 100011-1 | |
| Complete, EDTA free protease inhibitors | Roche | 11873580001 | |
| Conalbumin | Sigma | C7786 | |
| Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma | L7647 | |
| Cu, Zn Superoxide dismutase | Sigma | S9697 | |
| Ferritin | Sigma | F4503 | |
| ICP-MS multielemental calibration standards | AccuStandard | Made up to required concentrations in 1% nitric acid | |
| Microvolume UV spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| 65% Nitric acid | Millipore | 100441 | Diluted to 1% for use |
| Peek tubing | Agilent | 5042-6461 | |
| Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6x300mm, 3μm, 150Å | Agilent | 5190-2508 | |
| Sodium Chloride | Chem Supply | SA046 | |
| Tris Hydrochloride | ICN Biomedicals inc. | 103130 | |
| Thyroglobulin | Sigma | T9145 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V2876 |
References
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