Ex Vivo optogenética Dissection de Circuitos medo no cérebro Slices

ferramentas precisas para visualização e ativação simultânea de conexões específicas entre áreas do cérebro e tipos específicos de neurônios estão se tornando mais importante para entender as conectividade funcional subjacentes função cerebral e doença estados saudáveis. Idealmente, isso implica investigação fisiológica das propriedades sinápticos precisos com que identificaram os neurônios se comunicam. Isto é particularmente verdadeiro para as ligações entre as áreas do cérebro que não podem ser conservados em uma única fatia cerebral aguda. No passado, isto foi largamente conseguido em experiências separadas. Por um lado, marcadores neurais injectados in vivo, foram empregues combinada com luz ou subsequente análise microscópica de electrões de parceiros de pré- e pós-sinápticos. Por outro lado, quando a partir de feixes de fibras da região de origem são preservados e acessíveis na preparação fatia, estimulação eléctrica tem sido utilizada para avaliar os mecanismos de comunicação com células sinápticas na região alvo.

Com o advento de Optogenetics, a expressão específica de canais de catiões de luz fechado, tais como Channelrhodopsins (CHRS) fundida com proteínas fluorescentes, permite agora que a activação de neurónios e as suas trajectórias de axonais embora permitindo a sua visualização e post-hoc de análise anatómica ^{1- 4.} Porque axônios ChR expressam pode ser estimulada mesmo quando separado do somata pai ^5, é possível, em fatias de cérebro para: 1) avaliar entradas de regiões do cérebro que não eram acessíveis com estimulação elétrica convencional, porque tratos de fibras não são separáveis ​​ou a trajetória específica não é conhecida; 2) inequivocamente identificar a região de origem para entradas específicas que foram postuladas, mas incompletamente compreendida; e 3) investigar a conectividade funcional entre tipos celulares definidos, tanto a nível local e nas projeções de longo alcance. Devido a um certo número de vantagens, este mapeamento optogenetic de circuitos em fatias de cérebro tornou-se largamenteLY utilizado nos últimos anos e uma variedade de vectores virais para expressão de chrs marcadas com fluorescência estão prontamente disponíveis a partir de fornecedores comerciais. Algumas das principais vantagens da ativação optogenetic sobre estimulação elétrica convencional não são danos ao tecido devido à colocação de eletrodos de estimulação, a especificidade da estimulação da fibra, porque a estimulação elétrica pode também recrutar fibras de passagem ou outras células vizinhas, e um estímulo igualmente rápida e temporalmente preciso. Além disso, a injecção estereotáxica de vectores virais pode ser facilmente orientada para áreas específicas do cérebro ⁶ e expressão específica condicional ou tipo de célula pode ser conseguido usando expressão de Cre-dependente e / ou promotores específicos ^7. Aqui, esta técnica é aplicada para o mapeamento de longo alcance e circuitos locais no sistema de medo.

A amígdala é uma região-chave para a aquisição e expressão do medo, e armazenamento de medo e memórias emocionais ^8,9. Além froestou a amígdala, o córtex pré-frontal medial (mPFC) e hipocampo (HC), estruturas que são mutuamente ligadas à amígdala, estão implicadas nos aspectos de aquisição, consolidação e recuperação de medo e extinção memórias ^10,11. Actividade em subdivisões do mPFC parece desempenhar um papel duplo no controle de alta e baixa medo afirma ^12,13. Isso pode em parte ser mediada por conexões diretas de mPFC para a amígdala que controlaria atividade da amígdala e saída. Por isso, nos últimos anos, vários estudos começaram em ex vivo experimentos fatia para investigar as interações sinápticas entre aferentes mPFC e células-alvo específicos na amígdala ^14-17.

Durante a aprendizagem medo, a informação sensorial sobre os estímulos condicionado e incondicionado atinge a amígdala através de projeções de regiões do tálamo e córtex específicos. Plasticidade destes insumos aos neurônios na parte lateral (LA) da basolamígdala ateral (BLA) é um importante mecanismo subjacente medo condicionado ^9,18. Evidências crescentes sugerem que os processos de plástico paralelas na amígdala envolvem elementos inibitórios para controlar memória do medo ^19. Um grupo de neurônios inibitórios em cluster são os GABAérgicos paracapsular intercalados células mediais (mpITCs), mas a sua conectividade e função precisa não é completamente compreendida ^20-22. Aqui, o mapeamento do circuito optogenética é utilizado para avaliar aferentes e eferentes conectividade dessas células e seu impacto sobre os neurônios-alvo na amígdala, demonstrando que mpITCs recebe entrada sensorial direta de estações retransmissoras talâmicos e corticais ^23. expressão específica do ChR em mpITCs ou neurônios BLA permite o mapeamento das interações locais, revelando que mpITCs inibir, mas também são mutuamente ativado por, BLA principais neurônios, colocando-os em circuitos inibitórios feed-forward e feedback novos que controlam eficazmente a atividade BLA23.