Identificación de las nanopartículas de óxido de metal en muestras histológicas por Enhanced Mapeo de campo oscuro Microscopía y hiperespectrales
Summary
Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.
Abstract
Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.
Introduction
Como los nanomateriales se utilizan cada vez más en una variedad de industrias y aplicaciones, existe una necesidad de métodos de imagen nanoescala y caracterización que son más rápida, asequible y conveniente que las modalidades tradicionales, como la microscopía electrónica. Para visualizar de nanopartículas (NP) interacciones con las células, los tejidos y los sistemas vivos, han sido empleadas muchas técnicas ópticas, incluyendo contraste de interferencia diferencial (DIC) microscopia 1 y enfoques basados en el campo evanescente, como reflexión total interna (TIR) o casi microscopía de barrido de campo óptico (NSOM) 2,3. Sin embargo, estos son los enfoques analíticos de gama alta, fuera del alcance de la mayoría de los laboratorios no especializados 4. La microscopía electrónica, incluyendo microscopía electrónica de transmisión (TEM), también se ha utilizado para estudiar la interacción con las células NP 5,6,7,8. Alto ángulo anular campo oscuro (HAADF) microscopía de barrido electrónico de transmisión se ha utilizado para estudiar la interacción de PNcon virus 9. La microscopía confocal es otra técnica popular usado para estudiar las interacciones célula-NP 10.
En los últimos años, las imágenes hiperespectrales (HSI) técnicas basadas en campo oscuro se han utilizado como una herramienta analítica prometedora para el estudio de NPs en matrices biológicas 11. Sistemas de HSI generar una representación tridimensional de datos espaciales y espectrales, conocidos como un hipercubo o cubo de datos 12. El mapa espacial de la variación espectral se utiliza para la identificación de los materiales. Perfiles espectrales de materiales conocidos pueden ser generados y utilizados como bibliotecas de referencia para la comparación con muestras desconocidas. Una de las principales ventajas con sistemas de HSI es su capacidad de combinar formación de imágenes con la espectroscopia, estableciendo de ese modo la ubicación y distribución de los NPs desconocidos in vivo o ex vivo, así como su vinculación a otra partícula de referencia conocida, la composición similar.
Hay varias ventajas deutilizando sistemas HSI sobre las técnicas de imagen convencionales: se requiere preparación de la muestra mínima; preparación de la muestra es típicamente no destructiva en la naturaleza; adquisición y análisis de imágenes es más rápida; la técnica es rentable 13; y la distribución espacial y el análisis de los compuestos de composición mixta y / o en matrices complejas se logra más fácilmente 14.
Para la investigación nanomateriales con muestras preciosos, una de las consideraciones más importantes es la disponibilidad de un método de imagen no destructiva, que permite el potencial para examinar repetidamente muestras mediante uno o más métodos. Repetidas o múltiples análisis pueden ser deseables para desarrollar conjuntos de datos exhaustivos que no estarían disponibles en un solo método. En este sentido, el estudio de sus propiedades ópticas es la forma más segura de analizar la muestra. Mediante el uso de un microscopio de campo oscuro mejorada (EDFM) y el sistema de HSI para estudiar la respuesta óptica de la muestra – a saber Reflectance, sino también de absorbancia y transmitancia – identificación de características y caracterización se puede realizar 15. Los puntos finales de caracterización de potenciales incluyen una evaluación de tamaño relativo y la forma de nanopartículas o aglomerados y distribución de las nanopartículas dentro de una muestra.
En este trabajo, se describen los métodos de asignación específica para nanopartículas de óxido de metal en el tejido post-mortem utilizando un sistema HSI basado en un algoritmo de coincidencia píxel espectral se refiere como un asignador ángulo espectral (SAM). Elegimos esta aplicación en particular, ya que tiene el potencial para complementar actual y futura en la investigación nanotoxicología vivo, en el que se utilizan modelos animales para evaluar las implicaciones para la salud de la exposición a los nanomateriales artificiales. La aplicación de este método también podría informar a la investigación de administración de fármacos a nanoescala que utiliza modelos de tejidos o animales. En particular, la absorción de nanopartículas, distribución, metabolismo y excreción en toda organs y tejidos podrían ser investigados con este sistema. Una amplia variedad de aplicaciones están siendo investigados para su uso en investigación biomédica 11.
Este método podría ser utilizado para la evaluación de diferentes muestras biológicas (tales como tipos diversos tejidos, muestras de lavado broncoalveolar, y frotis de sangre) que han sido expuestas a las nanopartículas de una variedad de composiciones elementales 16-19. Además, este método es útil para el estudio de biodistribución de nanopartículas in vivo e in vitro, lo que es pertinente para los estudios de administración de fármacos a nanoescala 11. Más allá de muestras biológicas, EDFM y HSI se pueden utilizar para evaluar las nanopartículas en muestras ambientales, tales como aguas residuales 20. Evaluación de la exposición ocupacional puede ser facilitada por el uso de esta técnica, así, ya que se puede utilizar para evaluar la eficacia del equipo de protección personal en la prevención de la penetración de nanopartículas. Además, el TE investigaciónam está desarrollando actualmente un EDFM similar y protocolo de HSI para la evaluación de muestras de medios filtrantes de nanopartículas obtenidos de las evaluaciones de exposición ocupacional. Si bien la preparación de estos diferentes tipos de muestras para EDFM y HSI puede variar, es importante que están preparados de tal manera que puedan ser fácilmente visualizados por el sistema óptico. Típicamente, la muestra se debe preparar como si fuera a ser visualizado a través de microscopía de campo claro tradicional. Hay varios sistemas de imagen hiperespectral disponibles en el mercado 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para muestras de tejido que han sido sometidos a tinción histológica convencional, la identificación y análisis de las nanopartículas de óxido de metal se pueden conseguir a través de una combinación de EDFM, mapeo HSI, y técnicas de análisis de imagen. Si bien no es la flexibilidad en la preparación de muestras para histología o inmunohistoquímica (por ejemplo, utilizando tejidos fijados o congelados; tipo de mancha), es importante que las muestras se seccionaron a un espesor de 5.10 micras para la visualización óptima. Las muestras utilizadas aquí fueron fijados con formalina y embebidos en parafina antes de seccionar con un micrótomo rotatorio a 6 m de espesor, montado sobre portaobjetos de vidrio, se tiñeron con hematoxilina y eosina y coverslipped. Tejidos de la piel de cerdo procedentes de una colaboración toxicología penetración cutánea ex vivo se utilizaron para este estudio. Los tejidos fueron expuestos a nanopartículas de óxido de metal (alúmina, sílice, óxido de cerio) en suspensiones acuosas. La detección de la región (s) de interés (eleme alto contrasteNTS) con EDFM es un primer paso crítico que facilita el mapeo posterior HSI y análisis. Muestras de control positivo y negativo deben ser reflejados y se analizaron primero con el fin de crear una biblioteca espectral para referencia. Los espectros de recogida del control positivo se exportan a una biblioteca espectral control positivo. A continuación, todos los espectros de las imágenes de control negativo se resta de la biblioteca espectral del control positivo con el fin de mejorar la especificidad (reducir los falsos positivos). La biblioteca espectral filtrada resultante se considera el RSL que sirve para el análisis de materiales de interés. Todas las muestras de tejido se someten al mismo proceso de formación de imágenes y se asignan contra el RSL. La imagen resultante contendrá sólo las zonas con elementos de interés sobre un fondo negro. Esta imagen podría entonces ser analizada con ImageJ utilizando sus funciones de umbral y el análisis de partículas para obtener el área de las partículas mapeadas por campo de visión. Los datos numéricos obtenidos a partir de ImageJ pueden ser de exportacióned a una hoja de cálculo para su posterior análisis.
Es importante tener en cuenta que a medida que las muestras biológicas son intrínsecamente diferentes entre sí, y los métodos de tinción pueden afectar la visualización a través EDFM y HSI, los ajustes de exposición deben ser determinadas de acuerdo a lo que produce la mejor imagen de alto contraste para un tipo específico de la muestra. Aunque la reducción de falsos positivos se puede lograr a través de la filtración de las bibliotecas espectrales, es crucial para obtener controles negativos fiables que han evitado la contaminación con el elemento de interés, como los espectros correspondientes a esta contaminación podría potencialmente ser filtrada desde la biblioteca espectral del control positivo , el aumento de las tasas de falsos negativos. Además, el rango de intensidad del espectro que es detectable con el software de imágenes hiperespectrales no puede superar el límite del software en particular (para este estudio, es decir 16.000 unidades): áreas con un alto número de partículas acumuladas que producen spintensidades ectral superiores al límite de intensidad se quedan fuera de la biblioteca espectral, debido al riesgo de aumentar el número de falsos negativos.
Mientras que el sistema HSI confiere muchas ventajas sobre los métodos tradicionales, hay algunos inconvenientes y limitaciones a considerar. Una es que la gran cantidad de datos ópticos recogidos pueden requerir poder sustancial de computación. Otra es que HSI puede ser que requiere mucho tiempo, sobre todo en las etapas iniciales, cuando se están creando bibliotecas espectrales de referencia. Además, el tiempo de formación de imágenes puede requerir varios minutos por la captura de imágenes, por lo que es más lenta que la imagen de campo oscuro sencilla; Sin embargo, todavía es más rápido que la realización de la preparación de muestreo y visualización mediante microscopía electrónica. Además, los sistemas complejos pueden dar lugar a múltiples espectros característicos, que requieren el desarrollo de controles de alta especialización y hacen que la creación de bibliotecas de referencia universales estandarizados difíciles 26. Por último, la tecnologíaresultados nique en una resolución más baja que las técnicas probe- o microscopía de electrones, como la microscopía de fuerza atómica o microscopía electrónica de transmisión, que pueden resolver los átomos individuales. La resolución de esta técnica es limitada debido a su naturaleza fotónica, que le impide ser una herramienta de alta precisión para la medición de tamaños de partículas a nivel nanométrico o para localizar con precisión los materiales a un nivel inferior a la micra. Mientras que la técnica puede ser capaz de identificar partículas dentro de ciertos compartimentos de tejidos u orgánulos celulares mayor que 1 m (tales como núcleos de célula), orgánulos más pequeños o características son difíciles de visualizar con precisión con este método. También hay que resaltar, por su resolución espacial, este método no puede diferenciar entre las nanopartículas individuales y aglomerados 11.
Otras consideraciones incluyen: ciertos materiales (tales como metales nobles) tienen mucho más alta reflectancia y perfiles espectrales distintas, que puede hacer que sean más fáciles de Analyze y mapa espectralmente con esta herramienta. Otros, tales como los óxidos de semi-metálicas investigadas en este estudio y los nanomateriales a base de carbono 24, 27, pueden ser más difícil debido a su composición elemental, forma, y dependiendo de la matriz. En dos estudios de inhalación murinos por Mercer et al., Se utilizó un sistema similar a la empleada en este estudio con el fin de localizar los nanotubos de carbono en el pulmón y en los órganos secundarios en función de su notablemente alto contraste con los tejidos circundantes. Sin embargo, la cartografía hiperespectrales no se demostró en ninguno de los estudios, probablemente debido a la forma única de fibras de carbono era un rasgo suficiente para su identificación. Otra consideración se refiere específicamente a los tejidos: desde el depósito de nanopartículas de interés para los órganos específicos a través de procesos biofísicos normales es impredecible (ya menudo en sí el objeto de estudio), la determinación de un control positivo aplicable puede ser difícil y requiere la consideración de cómo la generación del control mvuelo afectar el estado de un material de interés. Por ejemplo, si una biblioteca espectral se crea a partir de nanopartículas cristalinas de interés, puede ser difícil para mapear la biblioteca para esos mismos nanopartículas en tejidos o células debido a cambios en los espectros resultantes de la alteración de la partícula (por ejemplo, debido al cambio en pH, la disolución, la aglomeración, la proteína de unión) y el microambiente o matriz general. Por último, la técnica está limitada en su naturaleza semi-cuantitativa: sólo puede ser tan cuantitativa como otras técnicas de microscopía de dos dimensiones de resolución similar, lo que significa que no se puede utilizar fácilmente para realizar tareas tales como la caracterización de carga órgano total de un material.
En general, EDFM y HSI proporcionan varias ventajas sobre las técnicas de imagen nanomaterial y caracterización convencionales, tales como TEM, HAADF y DIC. EDFM / HSI permite la adquisición y análisis de imágenes más rápido, lo que ahorra tiempo y costes en comparación con más conven intensivatécnicas cionales. Además, la preparación de muestras para EDFM / HSI es típicamente tanto mínima y no destructivo, lo que ahorra tiempo y también permite el análisis más flexible de una muestra dada, ya que entonces se puede utilizar para otras técnicas. Además, HSI es versátil, permitiendo análisis de los materiales a nanoescala de muchas composiciones y en una variedad de matrices. El equipo de investigación está trabajando para perfeccionar el método descrito aquí por otros materiales y tipos de muestras, incluyendo una evaluación a fondo de la especificidad de la tecnología. Un siguiente paso crítico siendo investigado por el equipo de investigación es la validación de estas técnicas en contra de las normas de oro tradicionales (por ejemplo, Raman, TEM, SEM) para los materiales y tipos de tejidos de interés.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Günter Oberdörster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.
Materials
| CytoViva 150 Unit (condenser) | CytoViva (Auburn, AL) | mounted to Olympus BX43 microscope | |
| Olympus BX43 Microscope – Analyzer Slot – HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | for use with CytoViva 150 Unit condenser | |
| Dagexcel-M Digital Firewire Camera – Cooled; includes Exponent 7 software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | enhanced darkfield camera and software | |
| CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | hyperspectral camera and software | |
| cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides) | Schott NEXTERION | 1025087 | reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging |
| cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x 1.45mm) | Schott NEXTERION | custom | reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging |
| type A microscopy immersion oil | Fisher Scientific | 12368B | multiple suppliers |
| 70% isopropanol in water | multiple suppliers | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | free open-source software online download | |
| metal oxide nanoparticles | supplied to the research team by industrial partners | alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed. |
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